pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro
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1μg 100μg
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pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒表达mCherry便于观察转染效率或感染效果,同时携带了Hygro抗性,方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后,可以直接转染细胞进行基因编辑,也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。

慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造,删除了慢病毒绝大部分的致病基因,并使包装后的病毒失去了自我复制能力,安全性大大提升,并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。

本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后,切除图谱中标示的filler,把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中,就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。

本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下,Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂,随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换,从而可能产生移码突变,导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候,就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS),能够有效确保hSpCas9定位在细胞核,从而有效提高基因编辑效率。

本质粒表达的Cas9带有Flag标签,可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和mCherry之间通过P2A连接。mCherry与Cas9-Flag同时翻译,可以呈现很强的红色荧光,可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1),并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率。

图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。在大肠杆菌中呈现氨苄青霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后,可使用Hygromycin B (潮霉素B) (ST1389)筛选多克隆或单克隆细胞株。

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1-199
5' LTR (truncated) 217-397
HIV-1 Ψ 444-569
RRE 1062-1295
cPPT/CTS 1822-1939
U6 promoter 1990-2230
filler 2235-4119
gRNA scaffold 4120-4195
EF-1α core promoter 4257-4468
Kozak sequence 4487-4496
Cas9 4493-8596
nucleoplasmin NLS 8597-8644
FLAG 8645-8668
P2A 8678-8734
mCherry 8735-9445
WPRE 9461-10049
Factor Xa site 9932-9943
3' LTR (ΔU3) 10121-10354
bGH poly(A) signal 10386-10610
f1 ori 10656-11084
SV40 promoter 11098-11427
SV40 ori 11278-11413
EM7 promoter 11475-11522
HygR 11541-12566
SV40 poly(A) signal 12696-12817
M13 rev 12866-12882
lac operator 12890-12906
lac promoter 12914-12944
CAP binding site 12959-12980
ori 13268-13856
AmpR 14027-14887
AmpR promoter 14888-14992
CMV enhancer 15258-15637

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro质粒(15638bp)的图谱如下:

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8310 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro.pdf

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AscI AxyI Bse21I BsiWI BstHPI
Bsu36I Eco81I FseI FspAI HpaI I-CeuI I-PpoI
I-SceI KspAI MauBI MreI PaeR7I PalAI Pfl23II
PI-PspI PI-SceI PspLI PspXI RigI SfiI Sfr274I
SgsI SlaI SrfI XhoI

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro中的单酶切位点包括:

Acc65I G`GTAC,C 1984 PacI TTA,AT`TAA 1980
AfeI AGC|GCT 4483 PasI CC`CWG,GG 6262
AgeI A`CCGG,T 4470 PflFI GACN`N,NGTC 12045
AsiSI GCG,AT`CGC 11905 PmeI GTTT|AAAC 10364
AvrII C`CTAG,G 11412 PshAI GACNN|NNGTC 11568
BamHI G`GATC,C 8669 RsrII CG`GWC,CG 11949
BmtI G,CTAG`C 4212 SacII CC,GC`GG 9964
BspDI AT`CG,AT 3277 SbfI CC,TGCA`GG 9090
BsrGI T`GTAC,A 9435 SexAI A`CCWGG,T 11179
BssHII G`CGCG,C 474 SgrAI CR`CCGG,YG 9416
BstBI TT`CG,AA 2849 SgrDI CG`TCGA,CG 15021
BstZ17I GTA|TAC 12828 SmaI CCC|GGG 11435
ClaI AT`CG,AT 3277 SnaBI TAC|GTA 15613
EcoRI G`AATT,C 4202 SpeI A`CTAG,T 15272
EcoRV GAT|ATC 6346 SwaI ATTT|AAAT 3632
FspI TGC|GCA 14322 TspMI C`CCGG,G 11433
KpnI G,GTAC`C 1988 Tth111I GACN`N,NGTC 12045
NheI G`CTAG,C 4208 XbaI T`CTAG,A 4476
NotI GC`GGCC,GC 907 XmaI C`CCGG,G 11433

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro质粒可使用的测序引物序列如下:

sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro的全序列信息:D8310 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8310-1μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro 1μg
D8310-100μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.本质粒构建方案如下,仅供参考。
a.质粒酶切和去磷酸化。
Reagent Volume
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro xμl (1-2μg)
FastDigest BsmBI 1μl
BeyoAP Alkaline Phosphatase (D7027) 1μl
10X FastDigest Buffer 2μl
100mM DTT 0.2μl
ddH2O (15.8-x)μl
Total volume 20μl
Incubate at 37℃ for 30min
b.使用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切后的质粒。
如果质粒成功被BsmBI酶切,则会产生两个片段,一个大的为目的片段,小片段为filler。酶切电泳鉴定后,切胶胶回收12kb的目的条带,弃去约2kb的filler条带。
c.磷酸化和退火Oligos。
Reagent Volume
sgRNA oligo 1 (100μM) 1μl
sgRNA oligo 2 (100μM) 1μl
10X T4 Ligation Buffer 1μl
ddH2O 6.5μl
T4 Polynucleotide Kinase (D7096) 0.5μl
Total volume 10μl
设计Oligo的原则如下:
Forward: 5'-CACCG-20bp-3'
Reverse: 5'-AAAC-20bp (Copy bottom strand 5'->3')-C-3'
注1:反应中请使用T4 Ligation Buffer,因为随T4 Polynucleotide Kinase (D7096)提供的缓冲液不包含ATP。如果使用随T4 Polynucleotide Kinase (D7096)提供的缓冲液,请补充1mM ATP。
注2:使用以下参数将磷酸化/退火反应放入热循环仪中:37℃ 30min,95℃ 5min,然后以5℃/min的速度下降到25℃。
d.将步骤3c中退火的双链寡核苷酸以1:200的比例稀释到超纯水中。
e.按照常规连接方式进行连接反应。
取50ng步骤3b中经BsmBI酶切且纯化后的质粒,与1μl步骤3d中稀释后的双链寡核苷酸进行连接,具体连接用量与步骤参照所使用的连接试剂盒说明书进行。推荐使用碧云天生产的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)进行连接反应。建议同时设置阴性对照(仅含有载体,用水代替退火的双链寡核苷酸)。
f.转化至Stbl3菌。
本质粒包含长末端重复序列(LTR),适合转化至重组缺陷菌,使用Stbl3甘油菌(D0378)能够获得的质粒产量。尽管其它RecA菌株可能有效,但我们测试发现使用Stbl3的转化效率和质粒产量都总体更加理想。
g.直接转染细胞或进行慢病毒的包装。
推荐使用碧云天生产的Lipo8000™转染试剂(C0533)转染细胞。构建好的质粒后续也可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。
参考文献:
1.Mautino MR. Curr Gene Ther. 2002. 2(1):23-43.
2.Sumimoto H, Kawakami Y. Future Oncol. 2007. 3(6):655-664.
3.Stripecke R, Koya RC, Ta HQ, Kasahara N, Levine AM. Blood Cells Mol Dis. 2003. 31(1):28-37.
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