pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒表达绿色荧光蛋白EGFP (Enhanced green fluorescent protein)便于观察转染效率或感染效果，同时携带了Hygro抗性，方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后，可以直接转染细胞进行基因编辑，也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。
慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造，删除了慢病毒绝大部分的致病基因，并使包装后的病毒失去了自我复制能力，安全性大大提升，并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。
本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后，切除图谱中标示的filler，把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中，就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。
本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下，Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂，随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候，就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)，能够有效确保hSpCas9定位在细胞核，从而有效提高基因编辑效率。
本质粒表达的Cas9带有Flag标签，可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和EGFP之间通过P2A连接。EGFP与Cas9-Flag同时翻译，可以呈现很强的绿色荧光，可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1)，并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率。
图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。
本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。在大肠杆菌中呈现氨苄青霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后，可使用Hygromycin B (潮霉素B) (ST1389)筛选多克隆或单克隆细胞株。
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 1-199 |
| 5' LTR (truncated) | 217-397 |
| HIV-1 Ψ | 444-569 |
| RRE | 1062-1295 |
| cPPT/CTS | 1822-1939 |
| U6 promoter | 1990-2230 |
| filler | 2235-4119 |
| gRNA scaffold | 4120-4195 |
| EF-1α core promoter | 4257-4468 |
| Kozak sequence | 4487-4496 |
| Cas9 | 4493-8596 |
| nucleoplasmin NLS | 8597-8644 |
| FLAG | 8645-8668 |
| P2A | 8678-8734 |
| EGFP | 8735-9454 |
| WPRE | 9470-10058 |
| Factor Xa site | 9941-9952 |
| 3' LTR (ΔU3) | 10130-10363 |
| bGH poly(A) signal | 10395-10619 |
| f1 ori | 10665-11093 |
| SV40 promoter | 11107-11436 |
| SV40 ori | 11287-11422 |
| EM7 promoter | 11484-11531 |
| HygR | 11550-12575 |
| SV40 poly(A) signal | 12705-12826 |
| M13 rev | 12875-12891 |
| lac operator | 12899-12915 |
| lac promoter | 12923-12953 |
| CAP binding site | 12968-12989 |
| ori | 13277-13865 |
| AmpR | 14036-14896 |
| AmpR promoter | 14897-15001 |
| CMV enhancer | 15267-15646 |
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒(15647bp)的图谱如下：
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D8309 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro.pdf
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AscI | AxyI | Bse21I | BsiWI | BstEII |
| BstHPI | BstPI | Bsu36I | Eco81I | Eco91I | EcoO65I | FseI |
| FspAI | HpaI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KspAI | MauBI |
| MreI | PaeR7I | PalAI | Pfl23II | PI-PspI | PI-SceI | PspEI |
| PspLI | PspXI | RigI | SbfI | SdaI | SfiI | Sfr274I |
| SgrAI | SgsI | SlaI | SrfI | Sse8387I | XhoI |
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro中的单酶切位点包括：
| Acc65I | G`GTAC,C | 1984 | NotI | GC`GGCC,GC | 907 |
| AfeI | AGC|GCT | 4483 | PacI | TTA,AT`TAA | 1980 |
| AgeI | A`CCGG,T | 4470 | PasI | CC`CWG,GG | 6262 |
| AsiSI | GCG,AT`CGC | 11914 | PflFI | GACN`N,NGTC | 12054 |
| AvrII | C`CTAG,G | 11421 | PluTI | G,GCGC`C | 404 |
| BamHI | G`GATC,C | 8669 | PmeI | GTTT|AAAC | 10373 |
| BbvCI | CC`TCA,GC | 1183 | PshAI | GACNN|NNGTC | 11577 |
| BmtI | G,CTAG`C | 4212 | RsrII | CG`GWC,CG | 11958 |
| BspDI | AT`CG,AT | 3277 | SacII | CC,GC`GG | 9973 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 9444 | SexAI | A`CCWGG,T | 11188 |
| BssHII | G`CGCG,C | 474 | SfoI | GGC|GCC | 402 |
| BstBI | TT`CG,AA | 2849 | SgrDI | CG`TCGA,CG | 15030 |
| BstZ17I | GTA|TAC | 12837 | SmaI | CCC|GGG | 11444 |
| ClaI | AT`CG,AT | 3277 | SnaBI | TAC|GTA | 15622 |
| EcoRI | G`AATT,C | 4202 | SpeI | A`CTAG,T | 15281 |
| EcoRV | GAT|ATC | 6346 | StuI | AGG|CCT | 11420 |
| FspI | TGC|GCA | 14331 | SwaI | ATTT|AAAT | 3632 |
| KasI | G`GCGC,C | 400 | TspMI | C`CCGG,G | 11442 |
| KpnI | G,GTAC`C | 1988 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 12054 |
| NarI | GG`CG,CC | 401 | XbaI | T`CTAG,A | 4476 |
| NheI | G`CTAG,C | 4208 | XmaI | C`CCGG,G | 11442 |
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro质粒可使用的测序引物序列如下：
sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro的全序列信息:D8309 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro序列.txt
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D8309-1μg | pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro | 1μg |
| D8309-100μg | pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro | 100μg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| Reagent | Volume |
| pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro | xμl (1-2μg) |
| FastDigest BsmBI | 1μl |
| BeyoAP Alkaline Phosphatase (D7027) | 1μl |
| 10X FastDigest Buffer | 2μl |
| 100mM DTT | 0.2μl |
| ddH2O | (15.8-x)μl |
| Total volume | 20μl |
| Incubate at 37℃ for 30min | |
| Reagent | Volume |
| sgRNA oligo 1 (100μM) | 1μl |
| sgRNA oligo 2 (100μM) | 1μl |
| 10X T4 Ligation Buffer | 1μl |
| ddH2O | 6.5μl |
| T4 Polynucleotide Kinase (D7096) | 0.5μl |
| Total volume | 10μl |
