pShuttle-CMV-C-His(腺病毒质粒)
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产品编号 D8123-100μg
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¥ 1169.00
产品包装:
1μg 100μg
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pShuttle-CMV-C-His是碧云天自行研发的用于构建表达C端与His tag(His标签)融合的目的蛋白的重组腺病毒包装用的穿梭质粒。本穿梭质粒构建后,需要和预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)以及重组腺病毒包装细胞配合使用才能完成重组腺病毒的包装。

pShuttle-CMV-C-His含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达;在多克隆位点的3'端含有一个可以编码His标签的序列,因此可以表达出含有His标签的融合蛋白,可以方便地使用抗His的抗体来识别目的蛋白,有利于目的蛋白检测和分离纯化。

本质粒为卡那霉素抗性。

重组腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一种常见的用于在培养细胞或动物体内表达外源基因的重要工具。重组腺病毒具有感染宿主细胞范围广、感染不依赖细胞分裂、高滴度及目的基因表达水平高等特性。最常用的腺病毒载体是人类血清5型腺病毒。改造后的人类血清5型腺病毒,删除了在病毒装配过程中起关键作用的E1基因和非必须的能表达逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的删除使得重组腺病毒不能自我复制,同时给外源基因的插入提供了空间,最长可插入7.5kb的外源基因。从而提高了重组腺病毒的的安全性和可操作性。再利用携带E1基因的AD-293、293A、HEK293等细胞作为包装细胞就可以完成重组腺病毒的包装。

pShuttle系列的穿梭质粒携带外源目的基因,经过Pme I线性化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转化到大肠杆菌BJ5183中,或者转化到已经预转化了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重组。BJ5183菌株表达recET基因,具有很高的基因同源重组(homologous recombination)活性,使带有目的基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1通过末端反向重复序列同源重组,实现外源基因与腺病毒基因组的整合。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备获得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。

目的基因引入时不能含有Pme I及Pac I这两个酶切位点,如果含有该两个酶切位点的目的基因,需要对该位点进行突变方可进行基因操作。

pShuttle-CMV-C-His质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
left inverted terminal repeat 1–103
encapsidation signal (ES) 183–331
CMV promoter 341–933
multiple cloning site 940–994
His tag 999-1025
SV40 polyA 1024–1251
Ad5 right arm homology 1256–3510
Ad5 left arm homology 3558–4441
right inverted terminal repeat 4442–4544
pBR322 origin 4752–5419
kanamycin resistance ORF 6228–7019

pShuttle-CMV-C-His质粒的图谱如下:

pShuttle-CMV-C-His质粒的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8123 pShuttle-CMV-C-His.pdf

pShuttle-CMV-C-His中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-His)包括:

Acc65 I Afl II Age I Asc I Asp718
Blp I BsiC I BsiW I BstB I Bsu36 I
Cla I Eco72 I EcoN I Esp I Fse I
Kpn I Nru I Pml I Pvu I Sfi I

pShuttle-CMV-C-His中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-His once)包括:

BsrG I T`GTAC,A 193 Hpa I GTT|AAC 1149
SnaB I TAC|GTA 679 PflM I CCAN,NNN`NTGG 1927
Nhe I G`CTAG,C 940 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 2366
Not I GC`GGCC,GC 945 Bbs I GAAGAC 8/12 3168
BamH I G`GATC,C 952 Bbv II GAAGAC 7/11 3169
Hind III A`AGCT,T 958 Bst1107 I GTA|TAC 3522
EcoR V GAT|ATC 966 Xca I GTA|TAC 3522
Sal I G`TCGA,C 970 Pme I CTTT|AAAC 3543
Mlu I A`CGCG,T 976 EcoR I G`AATT,C 3548
Bgl II A`GATC,T 982 Avr II C`CTAG,G 4090
PaeR7 I C`TCGA,G 988 BspH I T`CATG,A 5486
Xho I C`TCGA,G 988 Psp1406 I AA`CG,TT 5885
Xba I T`CTAG,A 994 Rsr II CG`GWC,CG 6891
Spe I A`CTAG,T 1027 Dra III CAC,NNN`GTG 7238
Sca I AGT|ACT 1032 Xmn I GAANN|NNTTC 7492

pShuttle-CMV-C-His质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´

Reverse primer (1041-1063): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´

pShuttle-CMV-C-His的全序列信息:pShuttle-CMV-C-His.txt

腺病毒包装的具体方法和步骤可以参考如下网页:

https://www.beyotime.com/support/pShuttle.htm

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8123-1µg pShuttle-CMV-C-His 1μg
D8123-100µg pShuttle-CMV-C-His 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pShuttle-CMV-C-His质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,插入目的基因时注意与His不能发生移码突变。携带目的基因的质粒经过Pme I线性化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转化到大肠杆菌BJ5183中,或者转化到已经已经预转了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中进行同源重组。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。
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