pARE-luc-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒)
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产品编号 D2113-100μg
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1μg 100μg
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pARE-luc-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒)是碧云天自行研发的用于检测基于顺式作用元件-抗氧化响应元件(Antioxidant response element, ARE)的转录活性水平的快速响应、超灵敏检测的报告基因质粒。本质粒的主要特点是使用了可以被细胞内泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)识别并快速降解的luciferase-CP (luc-CP),即包含了泛素化修饰识别序列CP (CL1 and PEST)的luciferase,确保了更低的背景表达和更好的响应性。

pARE-luc-CP是一种超灵敏快速降解型报告基因质粒(Super sensitive and destabilized reporter plasmid),也被称为是快速响应萤光素酶报告基因质粒(Rapid response luciferase reporter plasmid),是以碧云天的pGL6-CP质粒(D2093)为模板,在其多克隆位点插入了2个ARE结合位点,可以高灵敏度地检测顺式作用元件ARE的激活水平,可以用于检测细胞的抗氧化水平或氧化应激状态。pGL6-CP质粒是用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)报告基因检测的新一代质粒,该报告基因质粒和Promega公司的pGL3系列相比有了全面的改进。一方面对于luciferase的编码进行了改进,确保能更好地在哺乳动物细胞中进行表达;另一方面应用了快速降解型报告基因技术,在luciferase后增加了泛素-蛋白酶体系统识别和降解序列CL1和PEST,合并简称CP,从而可以促进luc-CP在细胞中的降解,降低萤光素酶的本底活性。同时整个质粒中可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理,在保持原有功能不变的情况下,使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到最低。

本质粒中的CP包含针对哺乳动物细胞密码子优化的降解序列hCL1和hPEST。CL1源自酿酒酵母的16个氨基酸序列,可以引导蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统降解[1];PEST源自小鼠鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase) C端的40个氨基酸序列(富含脯氨酸/proline (P)、谷氨酸/glutamic acid (E)、丝氨酸/serine (S)和苏氨酸/threonine (T),PEST),该序列可通过泛素-蛋白酶体系统促进蛋白质的降解[2]。与普通报告基因相比,快速降解型报告基因的背景更低,响应性更好,检测灵敏度更高,更适合监测动态变化过程,例如转录活性的节律变化等。

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

pARE-luc-CP质粒的图谱如下:

pARE-luc-CP质粒的主要信息如下:

Base pairs 5808
ARE response element (ARE RE) 32-77
Luciferase reporter gene 123-1772
hCL1 1779-1826
hPEST 1830-1949
SV40 late poly(A) signal 1005-2126
SV40 early enhancer/promoter 2320-2677
Synthetic neomycin phosphotransferase (Neor) coding region 2708-3502
Synthetic poly(A) signal 3527-3575
Reporter Vector primer 4 (RVprimer4) binding region 3642-3661
ColE1-derived plasmid replication origin 3899
Ampicillin 4690-5550
Synthetic poly(A) signal/transcriptional pause site 5655-5808
Reporter Vector primer 3 (RVprimer3) binding region 5757-5776

pARE-luc-CP的多克隆位点及ARE response element的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2113 pARE-luc-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒).pdf

pARE-luc-CP中没有的酶切位点包括:

Aat II Asc I Ase I Bsa I BsaA I BsiW I BspM II
BssH II Eco72 I EcoR I EcoR V Mlu I Nde I Nru I
PflM I Pme I Pml I Psp1406 I PspA I Rsr II Sac I
Sma I SnaB I Spl I Srf I Tth111 I Vsp I Xcm I
Xma I

pARE-luc-CP中的单酶切位点包括:

Sfi I GGCCN,NNN`NGGCC 8 Stu I AGG|CCT 2661
Bgl I GCCN,NNN`NGGC 8 EcoN I CCTNN`N,NNAGG 3182
Acc65 I G`GTAC,C 14 BstB I TT`CG,AA 3577
Asp718 G`GTAC,C 14 Sal I G`TCGA,C 3591
Kpn I G,GTAC`C 18 Afl III A`CRYG,T 3841
Nhe I G`CTAG,C 20 ApaL I G`TGCA,C 4155
PaeR7 I C`TCGA,G 26 Not I GC`GGCC,GC 4661
Xho I C`TCGA,G 26 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 4685
Bgl II A`GATC,T 78 BstE II G`GTNAC,C 4688
Hind III A`AGCT,T 88 Ahd I GACNN,N`NNGTC 4763
BsrG I T`GTAC,A 613 Bsu36 I CC`TNA,GG 5119
Gsu I CTGGAG 21/19 1503 Pvu I CG,AT`CG 5133
Bpm I CTGGAG 22/20 1503 Sac II CC,GC`GG 5157
Afl II A`CRYG,T 1802 Bst1107 I GTA|TAC 5273
Mun I C`AATT,G 2135 Spe I A`CTAG,T 5592
BamH I G`GATC,C 2228 BsmB I CGTCTC 7/11 5605

pARE-luc-CP质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

RVprimer3 (5757-5776): CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC

pARE-luc-CP的全序列信息:D2113 pARE-luc-CP(超灵敏快速降解型报告基因质粒)-序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D2113-1μg pARE-luc-CP 1μg
D2113-100μg pARE-luc-CP 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pARE-luc-CP可以用常规的细胞转染方法转染细胞。检测时可以采用碧云天的萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG005/RG006)双萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG027/RG028)
参考文献:
1.Gilon T, Chomsky O, Kulka R.G. EMBO J. 1998. 17:2759-66.
2.Rogers S, Wells R, Rechsteiner M. Science. 1986. 234 (4774):364-8.
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