Cell|碧云天产品助力植物蛋白抗肿瘤作用研究
2022年5月26日《Cell》杂志发表了北京大学杜鹏课题组的最新研究成果“A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency”。细胞周期异常激活是肿瘤发生的必要条件，目前已知许多miRNA都可以靶向并抑制相关细胞周期基因从而调控细胞增殖，而在多种人原发性肿瘤中，均存在miRNA的表达异常。 在植物中存在一种RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)，其对于siRNA介导的抗病毒免疫反应至关重要。RDR几乎在所有的真核生物中均有表达，除了具有次级免疫系统的脊椎动物。本文中，研究人员发现在多种人原发性肿瘤样本和对应肿瘤细胞系中，存在大量的1-nt-shortet-3’ 末端miRNA异构体累积，其无法与AGO2结合，因而无法行成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，无法完成对靶基因的调控表达。 利用跨物种生物工程，在哺乳动物细胞中表达RDR1则能够利用其核苷酸转移酶活性对这些miRNA异构体进行修饰，使其与AG02结合，激活miRNA通路，从而调控肿瘤细胞的细胞周期，抑制其增长。
为了实现在哺乳动物细胞中表达植物RDR1，研究人员将来自拟南芥 (At) 和水稻 (Os)的RDR1基因分别克隆到共表达EGFP蛋白的慢病毒载体中，然后利用该慢病毒载体感染不同的哺乳动物细胞，最终成功得到了13个稳定表达RDR1蛋白的细胞系，其中包括7个实体瘤细胞系：A549、HCT116、 HepG2、 HeLa、H1299、PC-3和U-2OS，3个血液瘤细胞系：Jurkat、K562和NALM6， 以及5个非肿瘤细胞系：NIH/3T3、RPE-1、 WPMY-1、mouse V6.5 和human WIBR3。结果显示，AtRDR1和OsRDR1蛋白只抑制肿瘤细胞系增殖，对其它5种细胞增殖无影响。GSEA和WB分析结果也表明，AtRDR1和OsRDR1对肿瘤细胞系中多种细胞周期关键蛋白均有一定的抑制作用。并且，RDR1短时间诱导也能够显著抑制肿瘤细胞系的细胞周期过程和相关基因，说明细胞周期相关基因可能是RDR1的直接作用靶点。 EdU/PI 染色显示，RDR1 的表达显着降低了 HCT116、HepG2 和 H1299 细胞中 S 期的细胞比例，增加了 G0/G1 期的细胞，而对非肿瘤细胞系则无影响。
此前有研究表明，植物中RDR1在小RNA相关通路中发挥重要作用，因此研究人员假设RDR1同样通过小RNA抑制动物细胞的细胞周期。为验证这一推测，研究人员对上述所有表达RDR1的细胞进行了小RNA测序。结果显示，在所有的肿瘤细胞中，均存在明显的miRNA表达上调，而在非肿瘤细胞系中则不存在这个现象。qRT-PCR分析和小RNA Northern印迹结果进一步证实了多种miRNA在肿瘤细胞中的表达增加。 考虑到在多种肿瘤中，miRNA缺乏和相关信号通路受到抑制是肿瘤发生发展的主要原因，因此研究人员推测，RDR1可以通过上调miRNA表达实现抑制肿瘤细胞的细胞周期和增殖等目的。为此，研究人员利用siRNA技术敲低了miRNA通路中某些关键蛋白的表达，例如DROSHA、DGCR8和AGO2，结果显示，这些关键蛋白的缺失均会影响RDR1对细胞周期蛋白和细胞增殖的抑制效果。 随后，研究人员又构建了具有AGO2过表达的肿瘤细胞系和非肿瘤细胞系，结果显示，虽然AGO2的过表达不直接影响细胞增殖，但它显著增强了RDR1对肿瘤细胞增殖和对细胞周期关键蛋白的抑制作用。说明，RDR1确实会利用miRNA信号通路调节肿瘤细胞的细胞周期。
为进一步了解RDR1调控miRNA通路的机制，研究人员对已公开发表的相关数据进行了系统分析，包括TCGA数据库的9980组肿瘤患者数据以及GEO数据库的肿瘤患者、肿瘤细胞系及正常组织数据。结果显示，在多种肿瘤患者和细胞系样本中，均出现了3'末端短 1-nt 的 miRNA 异构体的大量累积。并且，EMSA和MST实验证实，1-nt-shorter miRNA异构体与2-nt-miRNA相比，进入AGO2效率更低。 因此，研究人员认为，在肿瘤细胞中，大量存在的1-nt-shorter-miRNA异构体本身不稳定，且不能有效进入到AGO2中形成RISC，可能与肿瘤细胞中miRNA剂量减少有关。
在后续小RNA测序分析中，研究人员发现在RDR1异位表达的肿瘤细胞中，存在大量3’端单核苷酸加尾的成熟miRNA，而在非肿瘤细胞中则没有。多种实验表明RDR1能够识别1-nt-shorter miRNA双链，并对其进行3’末端单核苷酸修饰。因此研究人员推测，RDR1可以识别AGO2游离的1-nt-shorter miRNA双链异构体，并对其进行单核苷酸修饰。为证实这一猜想， 研究人员在表达RDR1的A549细胞中进行了AGO2敲除，随后进行测序分析，结果显示AGO2的缺失会增强RDR1对1-nt-shorter miRNA双链异构体的识别和修饰。
研究人员还验证了RDR1在小鼠体内的肿瘤清除效果。研究人员将RDR1诱导型肿瘤细胞注射入免疫缺陷小鼠体内建模。活体成像结果表明，大约7周后，在注射了OsRDR1诱导的A549细胞的小鼠中，肿瘤组织的信号密度大大降低。qRT-PCR和WB实验表明，野生型RDR1显著增加了miR-22、-182、-192和let 7g等miRNA的表达，并减少了异种移植肿瘤组织中CCND1、CCNE2、CDK6、PLK1和MCM2等多个关键细胞周期蛋白的表达。 同时，对于H1299和PC-3细胞所形成的肿瘤，RDR1也能够显著提高肿瘤组织中miRNA的表达，从而抑制肿瘤细胞周期。
同时，研究人员也评估了RDR1对于白血病小鼠的抗肿瘤作用，研究人员分别向NPG或NOG小鼠中注射了三种表达野生型RDR1或3DA突变型RDR1的白血病细胞系。与对照组或突变组相比，野生型RDR1能够显著增强miRNA表达，抑制三种白血病细胞的增殖，延长小鼠生存期。
最后，研究人员还测试了使用病毒载体或纳米粒等不同方法体内外传递RDR1的可能性。首先，研究人员将体外表达纯化的WT rAtRDR1和3DA突变rAtRDR1蛋白与藻红蛋白(R-PE)混合，制备成纳米颗粒，并将其转染至肿瘤细胞和非肿瘤细胞中。与R-PE对照组和突变组相比，WT rAtRDR1显著抑制了肿瘤细胞的增殖，并且增加了细胞中miRNA的累积，而对非肿瘤细胞则无影响。 转录组学研究结果表明，WT rAtRDR1通过靶向癌细胞中的多种细胞周期基因显著抑制细胞周期通路。利用AAV传递系统，研究人员在小鼠体内也获得了与上述类似的结果。经由AAV递送的RDR1显著减少了小鼠肿瘤组织的体积，增加了miRNA表达，靶向多种细胞周期基因，抑制细胞周期通路。说明，AAV递送系统能够被用于传递RDR1从而抑制小鼠体内肿瘤生长。
在研究中，研究人员使用了多种碧云天高品质产品，包括BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒)、D-Luciferin potassium salt (High Purity)、PMSF (100mM)、BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒等。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| P0018AS | BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒) | 100ml |
| P0018AM | BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒) | 500ml |
| ST198-25mg | D-Luciferin potassium salt (High Purity) | 25mg |
| ST198-100mg | D-Luciferin potassium salt (High Purity) | 100mg |
| ST198-500mg | D-Luciferin potassium salt (High Purity) | 500mg |
| ST198-2g | D-Luciferin potassium salt (High Purity) | 2g |
| ST198-10g | D-Luciferin potassium salt (High Purity) | 10g |
| ST506 | PMSF (100mM) | 10ml |
| C0071S | BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒 | 50-500次 |
| C0071L | BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒 | 200-2000次 |
论文链接：
Qi et al.,A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency, Cell (2022).
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.030