Phleomycin Powder (腐草霉素粉末)
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产品编号 ST1449-25mg
数量
¥ 889.00
产品包装:
5mg 0.25ml 1ml 25mg
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使用说明
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Phleomycin是以Phleomycin D1为主的结构类似的糖肽类抗生素混合物,中文名称为腐草霉素,是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。标准的Zeocin是以Phleomycin为有效成分,添加了辅料后的混合物。很多时候也把Phleomycin或Phleomycin D1称为Zeocin。标准的Zeocin添加了辅料,导致其中的有效成分含量下降,使用的时候请注意适当调整用量和浓度。

Phleomycin是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Phleomycin溶液呈现蓝色,无活性。当其进入细胞后,Phleomycin上的Cu2+被还原为一价铜离子(Cu+),并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除,导致Phleomycin被活化,能够结合到细胞内DNA上并使其断裂,最终导致细胞死亡。

对Phleomycin产生抗性的蛋白是来源于印度链球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因编码一种14kDa大小的蛋白[1],它能够以一定比率结合Phleomycin,使其不能结合细胞DNA,抑制其DNA断裂活性,从而使细胞对Phleomycin产生抗性。因此,Phleomycin可用来筛选表达Phleomycin抗性基因的多克隆或单克隆细胞,或用于相应的多克隆或单克隆细胞的维持性培养。

Phleomycin对于绝大多数好氧细胞均有效,常用于细菌(如大肠杆菌)、真核微生物(如酵母)及动植物细胞的筛选。大肠杆菌筛选推荐浓度为5μg/ml (低盐LB培养基,NaCl浓度不能超过5g/L);酵母筛选推荐浓度为10μg/ml (YPD或基本培养基);哺乳动物细胞筛选推荐浓度为5~50μg/ml (根据细胞类型选择合适的细胞培养液)。实际应用时,应针对不同的细胞系测试Phleomycin的浓度梯度,以确定最佳使用浓度。

Zeocin (博莱霉素) (ST1450/ST1451)也是博来霉素家族的糖肽抗生素,其有效成分和Phleomycin (腐草霉素)基本一致,都为Phleomycin D1,抗性基因也都为Sh ble。两者的配方有一定的区别,Zeocin是以Phleomycin D1为主要成分的一种配方,添加了不同的辅料,更适用于哺乳动物细胞的筛选;而Phleomycin是结构相似抗生素的混合物,它们的末端氨基有一定的区别,建议用于对Zeocin不敏感的细胞,如丝状真菌和一些酵母等。

化学性质(主要组分为Phleomycin D1):

化学名 (7R)-N1-[4-[[Amino(imino)methyl]amino]butyl]-7,8-dihydrobleomycinamide, hydrochloric
化学式 C55H85O21N20S2Cu, HCl
CAS号 11006-33-0
内毒素水平 < 1EU/mg
分子量 1525
溶解性 H2O: ≥20mg/ml

本产品溶液包装配制在HEPES溶液中,浓度为20mg/ml,经0.22μm滤膜过滤除菌,可以直接用于细胞培养。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
ST1449-5mg Phleomycin Powder (腐草霉素粉末) 5mg
ST1449-25mg Phleomycin Powder (腐草霉素粉末) 25mg
ST1449-0.25ml Phleomycin Solution (腐草霉素溶液, 20mg/ml) 0.25ml
ST1449-1ml Phleomycin Solution (腐草霉素溶液, 20mg/ml) 1ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC避光保存,至少一年有效。20mg/ml溶液包装适当避免反复冻融。

注意事项:

Phleomycin Powder易吸潮,粉末装每次使用后须旋紧盖子。

Phleomycin对人体有害,操作时请小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

高离子强度、酸或碱性都会抑制Phleomycin的活性,该抗生素在过高或过低pH及弱氧化剂的条件下不稳定,且变性不可逆。在培养细菌时,需适当降低细菌培养基的盐浓度(低盐LB培养基,NaCl浓度不能超过5g/L)并调整pH至7.5,从而使其保持活性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.细菌的筛选(以大肠杆菌为例)。
a.使用不含Tn5转座子元件的宿主细胞如Top10、DH5和DH10等进行筛选
b.需使用低盐LB培养基(10g胰蛋白胨,5g NaCl,5g酵母提取物,调整pH至7.5,加水定容至1L)以维持Phleomycin的活性。
c.Phleomycin筛选的推荐浓度为5μg/ml。
2.真菌的筛选(以酵母为例)。
a.适用于酿酒酵母和毕赤酵母。
b.培养基的选择:含1M山梨醇的YPD培养基(适用于电穿孔法转染细胞);YPD或基本培养基(适用于化学法转染细胞)。调整培养基pH至6.5~8.0,并选择使用最低有效浓度的Phleomycin进行筛选。
c.转染方法:需使用电穿孔或锂离子转染法。不要使用酵母原生质球(spheroplasting)进行Phleomycin抗性的转染及筛选,因为Phleomycin会导致原生质球的完全死亡。
d.Phleomycin筛选的推荐浓度为10μg/ml。具体浓度与酵母菌株、培养基pH以及离子强度有关。对于丝状真菌(filamentous fungi),Phleomycin筛选的推荐浓度为25-150μg/ml。
3.哺乳动物稳定表达细胞株的筛选。
Phleomycin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为5-50μg/ml。影响筛选浓度的主要因素包括离子强度、细胞类型、细胞生长密度以及生长速率。根据细胞类型的不同,需要1-2周可以筛选到Phleomycin抗性的细胞。在筛选稳定表达细胞株之前,需要先确定能够杀死未转染细胞的Phleomycin最佳工作浓度。Phleomycin的最佳工作浓度需要通过剂量效应曲线来确定。
a.细胞对Phleomycin敏感性的确定(杀灭曲线的建立)。
(a)接种细胞使得细胞密度约为25%,按照8、16或24个细胞培养孔(分别为单个培养孔、复孔和三复孔)准备培养的细胞,培养24h。
(b)去除细胞培养液,换成含不同浓度Phleomycin的新鲜筛选培养液(0, 5, 10, 20, 30, 40, 50μg/ml或更高)。
(c)每2-4天更换新鲜的筛选培养液,观察存活细胞的比例,选择在1-2周内杀死所有细胞的最低浓度作为最佳工作浓度。
b.筛选Phleomycin抗性的稳定细胞株。
(a)按照20%-30%的细胞密度接种细胞,培养过夜。
(b)转染携带Phleomycin抗性基因的质粒或感染携带Phleomycin抗性基因的病毒,同时设置没有转染质粒或感染病毒的细胞作为对照。说明:没有转染质粒或感染病毒的细胞,也需要同样进行转染质粒或感染病毒的相应实验操作。
(c)转染或感染48-72h后,换成含有最佳工作浓度的Phleomycin (由步骤a中的杀灭曲线确定)的新鲜培养液,继续培养。如果有必要,可以对细胞进行传代,略稀释后进行筛选培养。
(d)每2-4天更换含有Phleomycin的新鲜筛选培养液。
(e)对照组正常细胞100%死亡,Phleomycin抗性组中存活的细胞即为表达Phleomycin抗性基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。根据细胞种类和转染/筛选效率,单克隆细胞株的形成可能需要一周或更多的时间。
注意:若待筛选细胞对Phleomycin的抗性明显强于大部分细胞,则按照以下方法克服此类耐受性:用含Phleomycin培养液进行细胞接种培养,置于37ºC孵育2-3h,使得细胞贴壁。然后将细胞置于4ºC,2h。需要使用HEPES作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37ºC孵育。4ºC孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化,使得Phleomycin能发挥作用,杀死细胞。
c.稳定细胞株的维持培养。
可采取如下几种方式之一来维持培养稳定细胞株。
(a)使用含有与上述筛选稳定转染细胞株相同浓度的Phleomycin筛选培养液来维持培养。
(b)降低Phleomycin浓度为筛选浓度的一半进行维持培养。
(c)使用刚好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Phleomycin浓度来维持培养(根据杀灭曲线来判断)。
参考文献:
1.Li Z, Bock R. Nat Commun. 2018. 9(1):3451.
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