Phleomycin是以Phleomycin D1为主的结构类似的糖肽类抗生素混合物，中文名称为腐草霉素，是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。标准的Zeocin是以Phleomycin为有效成分，添加了辅料后的混合物。很多时候也把Phleomycin或Phleomycin D1称为Zeocin。标准的Zeocin添加了辅料，导致其中的有效成分含量下降，使用的时候请注意适当调整用量和浓度。

Phleomycin是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Phleomycin溶液呈现蓝色，无活性。当其进入细胞后，Phleomycin上的Cu2+被还原为一价铜离子(Cu+)，并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除，导致Phleomycin被活化，能够结合到细胞内DNA上并使其断裂，最终导致细胞死亡。

对Phleomycin产生抗性的蛋白是来源于印度链球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因编码一种14kDa大小的蛋白[1]，它能够以一定比率结合Phleomycin，使其不能结合细胞DNA，抑制其DNA断裂活性，从而使细胞对Phleomycin产生抗性。因此，Phleomycin可用来筛选表达Phleomycin抗性基因的多克隆或单克隆细胞，或用于相应的多克隆或单克隆细胞的维持性培养。

Phleomycin对于绝大多数好氧细胞均有效，常用于细菌(如大肠杆菌)、真核微生物(如酵母)及动植物细胞的筛选。大肠杆菌筛选推荐浓度为5μg/ml (低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；酵母筛选推荐浓度为10μg/ml (YPD或基本培养基)；哺乳动物细胞筛选推荐浓度为5~50μg/ml (根据细胞类型选择合适的细胞培养液)。实际应用时，应针对不同的细胞系测试Phleomycin的浓度梯度，以确定最佳使用浓度。

Zeocin (博莱霉素) (ST1450/ST1451)也是博来霉素家族的糖肽抗生素，其有效成分和Phleomycin (腐草霉素)基本一致，都为Phleomycin D1，抗性基因也都为Sh ble。两者的配方有一定的区别，Zeocin是以Phleomycin D1为主要成分的一种配方，添加了不同的辅料，更适用于哺乳动物细胞的筛选；而Phleomycin是结构相似抗生素的混合物，它们的末端氨基有一定的区别，建议用于对Zeocin不敏感的细胞，如丝状真菌和一些酵母等。

化学性质(主要组分为Phleomycin D1):

化学名	(7R)-N1-[4-[[Amino(imino)methyl]amino]butyl]-7,8-dihydrobleomycinamide, hydrochloric
化学式	C55H85O21N20S2Cu, HCl
CAS号	11006-33-0
内毒素水平	< 1EU/mg
分子量	1525
溶解性	H2O: ≥20mg/ml

本产品溶液包装配制在HEPES溶液中，浓度为20mg/ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，可以直接用于细胞培养。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
ST1449-5mg	Phleomycin Powder (腐草霉素粉末)	5mg
ST1449-25mg	Phleomycin Powder (腐草霉素粉末)	25mg
ST1449-0.25ml	Phleomycin Solution (腐草霉素溶液, 20mg/ml)	0.25ml
ST1449-1ml	Phleomycin Solution (腐草霉素溶液, 20mg/ml)	1ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20ºC避光保存，至少一年有效。20mg/ml溶液包装适当避免反复冻融。

注意事项：

Phleomycin Powder易吸潮，粉末装每次使用后须旋紧盖子。

Phleomycin对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

高离子强度、酸或碱性都会抑制Phleomycin的活性，该抗生素在过高或过低pH及弱氧化剂的条件下不稳定，且变性不可逆。在培养细菌时，需适当降低细菌培养基的盐浓度(低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)并调整pH至7.5，从而使其保持活性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.细菌的筛选(以大肠杆菌为例)。
a.使用不含Tn5转座子元件的宿主细胞如Top10、DH5和DH10等进行筛选
b.需使用低盐LB培养基(10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母提取物，调整pH至7.5，加水定容至1L)以维持Phleomycin的活性。
c.Phleomycin筛选的推荐浓度为5μg/ml。
2.真菌的筛选(以酵母为例)。
a.适用于酿酒酵母和毕赤酵母。
b.培养基的选择：含1M山梨醇的YPD培养基(适用于电穿孔法转染细胞)；YPD或基本培养基(适用于化学法转染细胞)。调整培养基pH至6.5~8.0，并选择使用最低有效浓度的Phleomycin进行筛选。
c.转染方法：需使用电穿孔或锂离子转染法。不要使用酵母原生质球(spheroplasting)进行Phleomycin抗性的转染及筛选，因为Phleomycin会导致原生质球的完全死亡。
d.Phleomycin筛选的推荐浓度为10μg/ml。具体浓度与酵母菌株、培养基pH以及离子强度有关。对于丝状真菌(filamentous fungi)，Phleomycin筛选的推荐浓度为25-150μg/ml。
3.哺乳动物稳定表达细胞株的筛选。
Phleomycin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为5-50μg/ml。影响筛选浓度的主要因素包括离子强度、细胞类型、细胞生长密度以及生长速率。根据细胞类型的不同，需要1-2周可以筛选到Phleomycin抗性的细胞。在筛选稳定表达细胞株之前，需要先确定能够杀死未转染细胞的Phleomycin最佳工作浓度。Phleomycin的最佳工作浓度需要通过剂量效应曲线来确定。
a.细胞对Phleomycin敏感性的确定(杀灭曲线的建立)。
(a)接种细胞使得细胞密度约为25%，按照8、16或24个细胞培养孔(分别为单个培养孔、复孔和三复孔)准备培养的细胞，培养24h。
(b)去除细胞培养液，换成含不同浓度Phleomycin的新鲜筛选培养液(0, 5, 10, 20, 30, 40, 50μg/ml或更高)。
(c)每2-4天更换新鲜的筛选培养液，观察存活细胞的比例，选择在1-2周内杀死所有细胞的最低浓度作为最佳工作浓度。
b.筛选Phleomycin抗性的稳定细胞株。
(a)按照20%-30%的细胞密度接种细胞，培养过夜。
(b)转染携带Phleomycin抗性基因的质粒或感染携带Phleomycin抗性基因的病毒，同时设置没有转染质粒或感染病毒的细胞作为对照。说明：没有转染质粒或感染病毒的细胞，也需要同样进行转染质粒或感染病毒的相应实验操作。
(c)转染或感染48-72h后，换成含有最佳工作浓度的Phleomycin (由步骤a中的杀灭曲线确定)的新鲜培养液，继续培养。如果有必要，可以对细胞进行传代，略稀释后进行筛选培养。
(d)每2-4天更换含有Phleomycin的新鲜筛选培养液。
(e)对照组正常细胞100%死亡，Phleomycin抗性组中存活的细胞即为表达Phleomycin抗性基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。根据细胞种类和转染/筛选效率，单克隆细胞株的形成可能需要一周或更多的时间。
注意：若待筛选细胞对Phleomycin的抗性明显强于大部分细胞，则按照以下方法克服此类耐受性：用含Phleomycin培养液进行细胞接种培养，置于37ºC孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4ºC，2h。需要使用HEPES作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37ºC孵育。4ºC孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Phleomycin能发挥作用，杀死细胞。
c.稳定细胞株的维持培养。
可采取如下几种方式之一来维持培养稳定细胞株。
(a)使用含有与上述筛选稳定转染细胞株相同浓度的Phleomycin筛选培养液来维持培养。
(b)降低Phleomycin浓度为筛选浓度的一半进行维持培养。
(c)使用刚好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Phleomycin浓度来维持培养(根据杀灭曲线来判断)。
参考文献：
1.Li Z, Bock R. Nat Commun. 2018. 9(1):3451.
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产品编号	产品名称	包装
ST018-1ml	Blasticidin S HCl (灭瘟素S)	10mg/ml×1ml
ST018-5ml	Blasticidin S HCl (灭瘟素S)	10mg/ml×5ml
ST018-10mg	Blasticidin S HCl (灭瘟素S)	10mg
ST018-50mg	Blasticidin S HCl (灭瘟素S)	50mg
ST039A	Doxycycline hyclate(盐酸强力霉素)	1g
ST039B	Doxycycline hyclate(盐酸强力霉素)	50g
ST081-1ml	G418 (遗传霉素)	50mg/ml×1ml
ST081-5ml	G418 (遗传霉素)	50mg/ml×5ml
ST081-1g	G418 (遗传霉素)	1g
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ST551-10mg	Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素)	10mg/ml×1ml
ST551-50mg	Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素)	10mg/ml×5ml
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ST1389-50mg	Hygromycin B (潮霉素B)	50mg
ST1389-250mg	Hygromycin B (潮霉素B)	250mg
ST1389-1g	Hygromycin B (潮霉素B)	1g
ST1389-5g	Hygromycin B (潮霉素B)	5g
ST1449-5mg	Phleomycin Power (腐草霉素粉末)	5mg
ST1449-25mg	Phleomycin Power (腐草霉素粉末)	25mg
ST1449-0.25ml	Phleomycin Solution (腐草霉素溶液, 20mg/ml)	0.25ml
ST1449-1ml	Phleomycin Solution (腐草霉素溶液, 20mg/ml)	1ml
ST1450-20mg	Zeocin (博莱霉素)	20mg
ST1450-100mg	Zeocin (博莱霉素)	100mg
ST1450-0.25ml	Zeocin (博莱霉素)	20mg/ml×0.25ml
ST1450-1ml	Zeocin (博莱霉素)	20mg/ml×1ml
ST1451-100mg	Zeocin Power (博莱霉素粉末)	100mg
ST1451-500mg	Zeocin Power (博莱霉素粉末)	500mg
ST1451-1ml	Zeocin Solution (博莱霉素溶液, 100mg/ml)	1ml
ST1451-5ml	Zeocin Solution (博莱霉素溶液, 100mg/ml)	1ml×5