碧云天研发的乙醇脱氢酶活性检测试剂盒(WST-8法) (Alcohol Dehydrogenase Activity Assay Kit with WST-8)，也称ADH Assay Kit with WST-8，是一种基于WST-8的显色反应，利用吸光度检测，简单、快速、高灵敏地对血清、血浆等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清等样品中乙醇脱氢酶活性进行检测的试剂盒。

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)是一类存在于许多生物体中的脱氢酶，可促进醇和醛或酮之间的相互转化。在人类和许多其他动物中，它们用于分解有毒有害的醇类，如乙醇脱氢酶氧化甲醇产生甲醛，最终产生甲酸[1]。在各种代谢物的生物合成过程中，它们还参与了部分醛、酮或醇基团的产生。在酵母、植物和许多细菌中，一些醇脱氢酶在发酵过程中催化逆反应，以确保NAD+的持续供应[2]。此外，乙醇脱氢酶在酒精中毒、药物依赖、药物代谢等方面也发挥重要作用，如甲吡唑(Fomepizole)通过竞争性抑制ADH，用于急性乙二醇中毒[3]。

本试剂盒的检测原理请参考图1。在乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)的作用下，乙醇(Ethanol)被氧化生成乙醛(Acetaldehyde)，在这一反应过程中NAD+被还原为NADH；生成的NADH在电子耦合试剂(Electron mediator)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的Formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中Formazan的生成量与样品中乙醇脱氢酶的活性成正比。

图1.碧云天乙醇脱氢酶活性检测试剂盒(WST-8法) (S0241)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒在样品体积为10µl时，可以检测活性低至0.02U/ml的乙醇脱氢酶，在0.02-10U/ml活性范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了乙醇脱氢酶标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，从而计算出样品中的乙醇脱氢酶活性。

图2.碧云天乙醇脱氢酶活性检测试剂盒(WST-8法) (S0241)检测乙醇脱氢酶标准品的标准曲线。10µl不同浓度的乙醇脱氢酶标准品，加入90µl ADH反应工作液并混匀后，37ºC避光孵育10分钟，在450nm处测定吸光度。乙醇脱氢酶标准品在0.02-10U/ml活性范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒应用范围广，检测速度快。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆等生物体液，细胞培养上清、组织或细胞及饮料样品等的检测。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。同时，本试剂盒的检测速度比较快，整个检测过程约20分钟即可完成。

按照使用说明操作，用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0241S-1	BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay	15ml
S0241S-2	ADH Assay Buffer	15ml
S0241S-3	Substrate A	200µl
S0241S-4	WST-8	200µl
S0241S-5	Substrate B	200µl
S0241S-6	ADH Standard (300U/ml)	20µl
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
S0241M-1	BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay	75ml
S0241M-2	ADH Assay Buffer	75ml
S0241M-3	Substrate A	1ml
S0241M-4	WST-8	1ml
S0241M-5	Substrate B	1ml
S0241M-6	ADH Standard (300U/ml)	100µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中WST-8须避光保存。

注意事项：

Substrate B具有一定的挥发性，使用后须及时旋紧管盖。

ADH Assay Buffer和Substrate需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它各种溶液使用时应在冰上进行。

血清、血浆等样品如果在4ºC保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品的准备。
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μlBeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay的比例加入裂解液，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。对于贴壁细胞，使用细胞刮或细胞铲，刮铲下细胞后再进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer H for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
注：对于细胞、组织等需要裂解的样品的准备，也可以用其它合适的裂解液进行裂解，但不同裂解液制备的样品的测定效果可能存在一定的差异，甚至有些裂解液可能会抑制酶活性。
2.试剂盒的准备。
a.融解ADH Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.ADH反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应90µl的体积配制适量的ADH反应工作液。均匀混合84µl ADH Assay Buffer、2µl Substrate A、2µl WST-8、2µl Substrate B，即可配制成90µl ADH反应工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的ADH反应工作液。具体配制方法参考下表。配制好的ADH反应工作液须现配现用。

Samples	1	10	20	50
ADH Assay Buffer (µl)	84	840	1680	4200
Substrate A (µl)	2	20	40	100
WST-8 (µl)	2	20	40	100
Substrate B (µl)	2	20	40	100
Working Solution (µl)	90	900	1800	4500

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：NADH的存在会对乙醇脱氢酶的检测产生干扰。如果样品含有NADH，需同时设置样品背景对照孔，加入不含Substrate B的ADH Working Solution，即配制ADH Working Solution时2µl Substrate B用ADH Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定。
a.乙醇脱氢酶标准曲线设置。
取2μl ADH Standard (300U/ml)，加入58μl ADH Assay Buffer，混匀，配制成活性为10U/ml的乙醇脱氢酶标准品。分别取10U/ml乙醇脱氢酶标准品0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用ADH Assay Buffer补足至10μl，此时，标准曲线的活性分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10U/ml。
b.取1-10μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入ADH Assay Buffer至样品孔中，补足至10µl。同时设置仅含ADH Assay Buffer的孔为空白对照。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中乙醇脱氢酶的大致活性，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了5倍稀释，加入的“稀释后的样品”为2µl，则n=5×10/2=25)。
c.各孔加入ADH反应工作液90µl，混匀，37ºC避光反应10分钟。
注：如果吸光度偏低，可适当延长反应时间，例如反应15或20分钟。随着反应时间的延长，高浓度标准品孔的信号值可能会达到平台期，从而导致其不在标准曲线的线性范围内，此时可以舍去异常点的数据，取在线性范围内的数据来拟合标准曲线。
d.在450nm处测定吸光度。
e.建立标准曲线，并计算样品中乙醇脱氢酶的活性(A)，如果样品的背景对照信号比较高，样品的信号值应减去样品背景对照的信号值。乙醇脱氢酶标准曲线可以参考图2，在0.02-10U/ml活性范围内有良好的线性关系。乙醇脱氢酶活性的计算公式如下：
C (U/ml)=A×n
注：A为步骤3e根据标准曲线确定的乙醇脱氢酶活性(U/ml)；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
乙醇脱氢酶酶活性单位的定义：在pH8.8、25℃条件下，一个单位每分钟可将1.0μmole乙醇转化为乙醛。
参考文献：
1.Ashurst JV, Nappe TM. StatPearls. 2023.
2.Leskovac V, Trivić S, Pericin D. FEMS Yeast Res. 2002. 2(4):481-94.
3.Velez LI, Shepherd G, Lee YC, Keyes DC. J Med Toxicol. 2007. 3(3):125-8.
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