碧云天研发生产的超氧阴离子活性氧检测试剂盒(DHE) (Reactive Oxygen Species Assay Kit for Superoxide Anion with DHE)，简称ROS Assay Kit for Superoxide Anion with DHE，是一种以DHE为荧光探针，快速灵敏地检测细胞内超氧阴离子活性氧的试剂盒。本试剂盒可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统进行检测。

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括超氧阴离子(·O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)等。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因素例如紫外照射、γ射线照射、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而可能导致肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等[1]。

Dihydroethidium简称DHE，是最常用的检测细胞内超氧化物阴离子水平的荧光探针。分子式为C21H21N3，分子量为315.41。

Dihydroethidium是一种最常用的超氧化物阴离子荧光检测探针。可以直接用于活细胞的标记。Dihydroethidium被活细胞摄入后，可以在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氢，产生Ethidium。Ethidium (例如溴化乙锭)可以和RNA或DNA结合产生红色荧光。当细胞内的超氧化物阴离子水平较高时，产生的Ethidium较多，红色荧光就较强，反之则较弱。这样就可以用dihydroethidium进行超氧化物阴离子水平的检测[2]。

Dihydroethidium本身为蓝色荧光，最大激发波长为370nm，最大发射波长为420nm，脱氢后和RNA或DNA结合产生红色荧光，最大激发波长为300nm，最大发射波长为610nm，实际观察时也可以使用535nm作为激发波长。

本试剂盒同时提供了DHE探针、阳性对照和检测缓冲液，使用更便捷。本试剂盒提供的DHE为1000X储存液，该溶液经过优化，对大多数细胞都适用；超氧阴离子活性氧阳性对照试剂Rosup II可短时间内诱导细胞活性氧生成。同时，本试剂盒提供了Assay Buffer，使用更便捷。使用本试剂盒检测NRK-52E和L-929细胞内超氧阴离子活性氧的效果参考图1、图2。

图1.碧云天超氧阴离子活性氧检测试剂盒(DHE) (S0064)检测NRK-52E (大鼠肾小管上皮细胞)细胞内超氧阴离子活性氧的效果图。正常的NRK-52E细胞中超氧化物阴离子含量很低，使用本试剂盒染色后细胞核内无明显红色荧光(图A)；使用超氧阴离子活性氧阳性对照试剂Rosup II处理细胞60分钟后，使用本试剂盒染色后细胞核内红色荧光显著增强(图B)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

图2.碧云天超氧阴离子活性氧检测试剂盒(DHE) (S0064)检测L-929 (小鼠成纤维细胞)细胞内超氧阴离子活性氧的效果图。正常的L-929细胞内超氧化物阴离子含量很低；使用超氧阴离子活性氧阳性对照试剂Rosup II处理细胞60分钟后，使用本试剂盒进行荧光染色后经流式细胞仪(图A)或酶标仪(图B)检测荧光强度显著升高。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒小包装，6孔板每孔检测体系的体积为1ml时，可以检测100次；96孔板每孔检测体系为100μl时，可以检测1000次。如果用于流式细胞仪，每个样品检测体系体积为0.5ml时，可以进行200次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0064S-1	DHE (1000X)	100μl
S0064S-2	Rosup II (1000X)	50μl
S0064S-3	Assay Buffer	200ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC避光保存，一年有效。其中DHE (1000X)须避光保存。

注意事项：

DHE (1000X)和Rosup II (1000X)第一次使用时请分装后-20ºC保存，避免反复冻融。

DHE易在空气中氧化，请尽量避免暴露于空气中。

DHE脱氢后产生一定毒性的Ethidium，请注意防护。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

Assay Buffer经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果Assay Buffer发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

BSA和酚红(Phenol red)对DHE的检测有干扰，需避免。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.DHE染色液的配制。
按照96孔板每孔100μl DHE染色液(DHE Staining Solution)的体系，参考下表配制适量的 DHE染色液，并充分混匀。

Samples	1	10	100
DHE (1000X)	0.1μl	1μl	10μl
Assay Buffer	99.9μl	999μl	9.99ml
DHE Staining Solution	100μl	1ml	10ml

注1：配制DHE染色液时注意避光，且须现配现用，稀释后不能长期保存。
注2：DHE最优先的推荐终浓度为1X，对大多数细胞都适用，但为了得到更理想的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，DHE的终浓度通常为0.5-2X。
注3：本试剂盒提供的Assay Buffer可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果比PBS或HBSS更好。也可以使用Assay Buffer外的其它合适的溶液配制，如无血清培养液、HBSS (C0218)或PBS等稀释DHE (1000X)。
2.阳性对照的设置。
将试剂盒中提供的超氧阴离子活性氧阳性对照Rosup II (1000X)按照推荐的1:1000的比例加入到细胞培养液中，通常处理细胞30-120分钟即可，具体处理时间可以根据细胞种类适当调整。随后按照下述各种检测方法的步骤加入DHE染色液，进行检测。
注1：超氧阴离子活性氧阳性对照试剂Rosup II可短时间内诱导细胞活性氧生成，终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X。
注2：仅在阳性对照孔中加入Rosup II作为阳性对照，其余孔不能加入Rosup II。
注3：Rosup II可能对某些细胞效果较弱或者完全没有效果。
3.荧光显微镜检测。
a.接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。
b.洗涤(选做)。对于贴壁细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用PBS洗涤1次。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，吸除培养液和PBS时推荐使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下，可以不使用PBS洗涤。真空泵推荐BeyoVac™台式真空吸液器(E6878/E6883)。
c.染色。加入适当体积的DHE染色液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育20分钟。孵育时间可在10-30分钟之间进行调整。
注：如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37ºC孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
d.检测。孵育结束后可以直接在荧光显微镜下观察染色效果。如果发现荧光背景比较高，可以酌情洗涤1-3次后再在荧光显微镜下观察染色效果。DHE为红色荧光，Ex/Em = 535/610nm。
4.流式细胞仪检测。
a.接种培养。将细胞接种于6孔板或细胞培养皿中，按实验设计对细胞进行一定处理。
b.细胞准备。贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为100万个细胞。
c.染色。对于上一步骤的100万个细胞的沉淀，加入1ml DHE染色液，重悬为单细胞悬液。37ºC避光孵育20分钟。孵育时间可在10-60分钟之间进行调整。
注1：如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37ºC孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：孵育后可以酌情用PBS或HBSS洗涤1-3次。
d.检测。可以直接进行流式细胞仪检测，也可以250-1000×g室温离心5分钟沉淀细胞，吸净液体后每个样品加入0.5ml检测缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪检测(DHE为红色荧光，Ex/Em = 535/610nm)。
注：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对DHE稀释倍数进行适当调整。
5.荧光酶标仪检测。
a.接种培养。将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)，每孔的细胞数需要控制在100-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。
b.洗涤(选做)。对于贴壁细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用PBS洗涤1次。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，吸除培养液和PBS时最好使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下，可以不使用PBS洗涤。真空泵推荐BeyoVac™台式真空吸液器(E6878/E6883)。
c.染色。加入适量的DHE染色液，通常96孔板每孔加入100μl。37ºC避光孵育20分钟。孵育时间可在10-30分钟之间进行调整。
注1：如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37ºC孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。
注2：孵育后可酌情用PBS或HBSS洗涤1-3次。
d.检测。孵育结束后，可直接用荧光酶标仪检测。如果发现荧光背景比较高，可以酌情洗涤1-3次后再用荧光酶标仪进行检测。DHE为红色荧光，Ex/Em = 535/610nm。通过对比对照组与处理组的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出药物刺激的效果。
参考文献：
1.Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, Xu Q, Griendling KK, et.al. Circ Res. 2018. 122(6):877-902.
2.Daiber A, Oelze M, Steven S, Kröller-Schön S, Münzel T. Redox Biol. 2017. 12:35-49.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
S0033	活性氧检测试剂盒	>100/>500次
S0038	过氧化氢检测试剂盒	150次
S0060	超氧化物检测试剂盒	100次
S0061	线粒体超氧化物检测试剂盒(MitoSOX Red)	20-200/100-1000次
S0063	Dihydroethidium (超氧化物阴离子荧光探针)	5mg
S0064S	超氧阴离子活性氧检测试剂盒(DHE)	100-1000次
S0067-100μg	SOSG (单线态氧绿色荧光探针)	100μg
S0068S	单线态氧检测试剂盒(SOSG)	30-300次
S0131	脂质氧化(MDA)检测试剂盒	100/500次
S0043	脂质过氧化检测试剂盒(BODIPY 581/591 C11)	100-1000/500-5000次