碧云天的活性氧检测试剂盒(含稀释液) (Reactive Oxygen Species Assay Kit with Diluent，也称ROS Assay Kit with Diluent)，是一种使用便捷、检测效果更有保障的提供了所需的稀释液，并利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平[1, 2]。

本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture)，浓度为50mg/ml。使用本试剂盒检测细胞内活性氧的效果请参考图1。本试剂盒同时提供了经优化的探针稀释液和Rosup稀释液，使用更便捷，通常可以确保获得更稳定可靠的检测效果。

图1.碧云天活性氧检测试剂盒(含稀释液) (S0034)检测L929 (小鼠成纤维细胞)细胞内活性氧的效果图。L929细胞使用本试剂盒装载DCFH-DA探针后用50μg/ml Rosup处理30分钟，随后PBS洗涤一次后用荧光显微镜检测。正常的L929细胞中探针几乎未被氧化成荧光化合物，细胞中的绿色荧光非常弱(图A, B)；使用活性氧阳性对照试剂Rosup处理使细胞内活性氧生成大幅增加，DCFH-DA与活性氧反应，细胞中的绿色荧光显著增强(图C, D)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。

本试剂盒小包装和中包装，6孔板每孔检测体系的体积为1ml时，分别可以检测100次和500次；96孔板每孔检测体系为100μl时，分别可以检测1000次和5000次。如果用于流式细胞仪，每个样品检测体系体积为0.5ml时，分别可以检测200次和1000次。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
S0034S-1	DCFH-DA (10mM)	0.1ml
S0034S-2	探针稀释液	100ml
S0034S-3	活性氧阳性对照(Rosup, 50mg/ml)	0.1ml
S0034S-4	Rosup稀释液	100ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
S0034M-1	DCFH-DA (10mM)	0.5ml
S0034M-2	探针稀释液	500ml
S0034M-3	活性氧阳性对照(Rosup, 50mg/ml)	0.5ml
S0034M-4	Rosup稀释液	500ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中DCFH-DA (10mM)须避光保存。

注意事项：

探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考下页图谱。

尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。

荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐使用碧云天BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)或BeyoGold™黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP965)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.装载探针
对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
注：活性氧阳性对照(Rosup)推荐使用本试剂盒提供的Rosup稀释液进行稀释，以确保获得良好的诱导效果。对于目的药物，也可以酌情使用Rosup稀释液进行稀释，以获得良好的诱导效果。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用探针稀释液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1毫升。37ºC细胞培养箱内孵育20分钟。用细胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1:1000用探针稀释液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37ºC细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用细胞外液(C0216)或酌情使用PBS、HBSS、无血清细胞培养液等适当溶液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。细胞外液推荐使用细胞外液(Extracellular Solution) (C0216)，PBS推荐使用PBS (C0221A)，HBSS推荐使用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218)。
说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。
2.检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3.参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考图2。
4.其它说明
阳性对照Rosup可以按照1:1000的比例用Rosup稀释液稀释后使用。例如装载好探针的细胞，直接吸除液体或离心后吸除液体，加入适当体积的按照1:1000稀释的Rosup阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照(Rosup)的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照(Rosup)的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照(Rosup)的浓度。对于特定的细胞，Rosup作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行摸索最佳工作浓度和作用时间，甚至某些细胞可能对Rosup不敏感。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。
探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
活性氧阳性对照(Rosup)仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照(Rosup)。
参考文献：
1.Rastogi RP, Singh SP, Häder DP, Sinha RP. Biochem Biophys Res Commun. 2010. 397(3):603-7.
2.Chen X, Zhong Z, Xu Z, Chen L, Wang Y. Free Radic Res. 2010. 44(6):587-604.
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