碧云天研发生产的Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7),即RNA生物素标记试剂盒(SP6/T7),是一种通过高效的SP6 RNA polymerase或T7 RNA polymerase进行体外转录,从而获得生物素标记的RNA探针的试剂盒。本试剂盒可以配合质粒pRNA-SP6-T7 (RNA体外转录质粒) (D2314)或其它在多克隆位点两侧有SP6或T7 promoter的质粒,在多克隆位点插入目的基因并线性化后使用。
本试剂盒的工作原理是利用带有SP6 Promoter (ATTTAGGTGACACTATAG)或T7 Promoter (TAATACGACTCACTATAGGG)的线性化质粒、PCR产物或合成的DNA片段等为模板,利用SP6 RNA Polymerase或T7 RNA Polymerase能在相对较短的时间内进行体外RNA转录的特性,以Biotin-16-UTP部分取代UTP,从而转录生成生物素标记的RNA探针[1]。
Biotin-16-UTP (Biotin-16-uridine-5'-triphosphate, 即生物素-16-尿苷-5'-三磷酸)是UTP (Uridine-5'-triphosphate, 即尿苷-5'-三磷酸)的生物活性类似物,在体外转录反应中很容易被SP6或T7 RNA Polymerase作为转录反应底物整合到RNA中[2]。由于使用的RNA Polymerase对天然核苷酸(Nucleoside triphosphate, NTP)和生物素标记核苷酸(Biotin-NTP)没有选择倾向性,因此每个RNA转录产物生物素标记的程度可以通过调节转录反应中NTP与Biotin-NTP的比例来控制。本试剂盒将Biotin-16-UTP的比例控制在约35%,使反应和标记效率之间达到较好的平衡。
碧云天Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7)以带有SP6或T7 Promoter的线性化质粒DNA为模板进行转录时的产量参考图1。本试剂盒在标准的RNA转录反应条件下,在20μl的反应体系中,使用1μg的线性化DNA模板(长度约3kb),37℃孵育2小时,转录产物长度约为500nt时,可合成约8-10μg生物素标记的RNA。合成的标记RNA的数量取决于模板DNA的数量、纯度以及转录产物的长度。进一步延长孵育时间并不会增加生物素标记RNA的产量,但可以通过按比例放大反应体系,获得更多的生物素标记RNA。
图1.碧云天Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) (R7061)的产量参考图。带有SP6 Promoter的线性化质粒DNA模板在SP6 RNA Polymerase作用下进行的转录(图A);带有T7 Promoter的线性化质粒DNA模板在T7 RNA Polymerase作用下进行的转录(图B)。在20µl反应体系中,通过使用1.0μg 3199bp的线性化质粒DNA为模板,在37℃分别孵育0、15、30、60、120、240分钟,随后70℃孵育10分钟终止反应;加入2μl DNase I, RNase-free (1U/µl),37℃孵育30分钟消化模板DNA,得到生物素标记的RNA转录产物长度为496nt;用苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀并用超微量紫外分光光度计检测得到的RNA产物量。实际产量会因具体实验条件的不同而产生差异,本图仅供参考。
使用本试剂盒获得的RNA探针应用范围广。本试剂盒转录合成的带生物素标记的RNA探针可用于Northern、Southern、原位杂交、RNase保护实验(RNase Protection Assay)等相关研究。
本试剂盒标记的RNA探针后续兼容多种检测方法。本试剂盒转录合成的带有生物素标记的RNA探针可以使用荧光基团、酶或抗体偶联的链霉亲和素(Streptavidin)进行检测。推荐使用辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303或A0305)与DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(P0202/P0203)或BeyoECL Moon (P0018F)联合使用进行检测,或者使用碱性磷酸酯酶标记Streptavidin (A0312)与BCIP-NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(C3206)联合使用进行检测。后者的检测效果请参考图2。
图2.碧云天Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) (R7061)转录合成生物素标记的RNA探针的检测效果图。在20µl反应体系中,通过使用1.0μg 3199bp的线性化质粒DNA为模板,在37℃孵育2小时;随后加入2μl DNase I (1U/µl),37℃孵育30分钟消化模板DNA,得到生物素修饰的RNA转录产物;用苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀纯化RNA产物,用超微量紫外分光光度计检测得到的RNA产物浓度。取适量体积的反应产物(样品中RNA含量分别为800、600、400、200和100ng)滴至尼龙膜(FFN13)上,待样品风干后,进行紫外交联;用Wash Buffer (0.1% Tween-20 in 1X PBS)洗涤3分钟,洗去未结合至膜上的RNA,再用Blocking Buffer (5% Non-fat milk in Wash Buffer)室温封闭1小时。将膜转移至碱性磷酸酯酶标记Streptavidin (A0312)的稀释液中,室温孵育2小时(或4℃孵育过夜);孵育结束后用Wash Buffer室温洗涤3-5次,每次5分钟;随后将洗涤过的尼龙膜浸泡在BCIP/NBT碱性磷酸酯酶染色工作液(C3206)中,室温避光孵育3-5分钟,直至显色至预期深浅;用蒸馏水室温洗涤1-2次,每次5分钟,终止显色反应,最后使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统记录化学发光效果。实验结果显示,与未进行生物素标记的RNA探针相比,使用本试剂盒生成的RNA探针能明显检测到生物素的存在,表明生物素成功标记在RNA上。图中检测效果仅供参考,不同的实验条件获得的检测效果可能会略有不同。
一个小包装的本试剂盒(R7061S)可以进行20个20μl体系的体外反转录反应;一个中包装的本试剂盒(R7061M)可以进行100个20μl体系的体外反转录反应。本试剂盒提供的试剂用于基于SP6或T7 promoter的RNA生物素标记都是足量的。
包装清单:产品编号 | 产品名称 | 包装 |
R7061S-1 | Nuclease-free Water | 0.5ml |
R7061S-2 | NTP Labeling Mix (10X) | 40μl |
R7061S-3 | Transcription Buffer (10X) | 40μl |
R7061S-4 | SP6 Control Template (0.5µg/µl) | 6μl |
R7061S-5 | T7 Control Template (0.5µg/µl) | 6μl |
R7061S-6 | SP6 RNA Polymerase | 40μl |
R7061S-7 | T7 RNA Polymerase | 40μl |
R7061S-8 | RNase Inhibitor | 10μl |
R7061S-9 | DNase I | 40μl |
— | 说明书 | 1份 |
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
R7061M-1 | Nuclease-free Water | 2ml |
R7061M-2 | NTP Labeling Mix (10X) | 200μl |
R7061M-3 | Transcription Buffer (10X) | 200μl |
R7061M-4 | SP6 Control Template (0.5µg/µl) | 20μl |
R7061M-5 | T7 Control Template (0.5µg/µl) | 20μl |
R7061M-6 | SP6 RNA Polymerase | 200μl |
R7061M-7 | T7 RNA Polymerase | 200μl |
R7061M-8 | RNase Inhibitor | 50μl |
R7061M-9 | DNase I | 200μl |
— | 说明书 | 1份 |
-20℃保存,至少一年有效。
注意事项:本试剂盒内所有试剂保存在-20℃,并尽量避免反复冻融。
所有试剂使用前请进行快速离心使液体沉降至管底后再开启使用。
需要自备的试剂:预冷无水乙醇、预冷70%乙醇、RNA纯化及其它相关的实验试剂耗材。
由于涉及RNA操作,请严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。
本试剂盒的反应体系通常为20µl,但可根据实际需求按比例放大反应体系。
建议尽量提高转录模板的质量和纯度,以保证生物素标记RNA的产量。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
Reagent | Volume | Final Concentration |
Nuclease-free Water | (13.5-x)μl | - |
Transcription Buffer (10X) | 2μl | 1X |
NTP Labeling Mix (10X) | 2μl | 1X |
Template DNA | xμl | 1μg |
RNase Inhibitor | 0.5μl | 1U/μl |
SP6/T7 RNA Polymerase | 2μl | - |
Total Volume | 20μl | - |
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
A0303 | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 0.2ml |
A0305-0.2ml | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 0.2ml |
A0305-1ml | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 1ml |
A0305-5ml | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 5ml |
A0312 | 碱性磷酸酯酶标记Streptavidin | 0.2ml |
P0202 | DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 | 共20ml |
P0203 | DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒 | 共100ml |
P0209-100ml | TMB显色液(ELISA HRP显色用) | 100ml |
P0209-500ml | TMB显色液(ELISA HRP显色用) | 500ml |
P0210-100ml | 增强型TMB显色液(ELISA HRP显色用) | 100ml |
P0210-500ml | 增强型TMB显色液(ELISA HRP显色用) | 500ml |
P0018FS | BeyoECL Moon (极超敏ECL化学发光试剂盒) | 100ml |
P0018FM | BeyoECL Moon (极超敏ECL化学发光试剂盒) | 500ml |
C3206 | BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒 | 共100ml |
D2314-1μg | pRNA-SP6-T7 (RNA体外转录质粒) | 1μg |
D2314-100μg | pRNA-SP6-T7 (RNA体外转录质粒) | 100μg |
D0033 | PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒 | 50次 |
D7037S | Klenow Fragment | 100U |
D7037M | Klenow Fragment | 1000U |
D7037L | Klenow Fragment | 5000U |
D7073 | DNase I | 200U |
D7076 | DNase I | 1000U |
D7378-250µl | ATP (100mM, Nuclease free) | 250µl |
D7378-1ml | ATP (100mM, Nuclease free) | 1ml |
D7378-5ml | ATP (100mM, Nuclease free) | 5ml |
D7379-250μl | CTP (100mM, Nuclease free) | 250µl |
D7379-1ml | CTP (100mM, Nuclease free) | 1ml |
D7379-5ml | CTP (100mM, Nuclease free) | 5ml |
D7380-250μl | GTP (100mM, Nuclease free) | 250µl |
D7380-1ml | GTP (100mM, Nuclease free) | 1ml |
D7380-5ml | GTP (100mM, Nuclease free) | 5ml |
D7381-250μl | UTP (100mM, Nuclease free) | 250µl |
D7381-1ml | UTP (100mM, Nuclease free) | 1ml |
D7381-5ml | UTP (100mM, Nuclease free) | 5ml |
D7383-1ml | NTP set (100mM each, Nuclease free) | 4×250µl |
D7385-500μl | NTP Mix (10mM each, Nuclease free) | 500μl |
D7385-2ml | NTP Mix (10mM each, Nuclease free) | 2ml |
D7387-250μl | NTP Mix (25mM each, Nuclease free) | 250μl |
D7387-1ml | NTP Mix (25mM each, Nuclease free) | 1ml |
D3308 | 化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒 | 1000cm2 |
D3118 | 生物素随机引物DNA标记试剂盒 | 10次 |
D0058S | 柱式PAGE胶DNA回收试剂盒 | 50次 |
D0059S | PAGE胶DNA回收试剂盒 | 50次 |
R0215-1ml | 2X RNA Loading Buffer | 1ml |
R0218S | Urea-PAGE凝胶配制试剂盒(RNA专用) | 可制20-30块胶 |
R0081-1ml | BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads (RNA纯化磁珠) | 1ml |
R0081-5ml | BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads (RNA纯化磁珠) | 5ml |
R0081-20ml | BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads (RNA纯化磁珠) | 20ml |
R0081-100ml | BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads (RNA纯化磁珠) | 100ml |
R7006 | SP6 RNA Polymerase | 1/5/25/100KU |
R7009 | T3 RNA Polymerase | 1/5/25/100KU |
R7012 | T7 RNA Polymerase | 1/5/25/100KU |
R7013 | T7 RNA Polymerase (High Concentration) | 25/100/500KU |
R7016 | T7 Quick High Yield RNA Transcription Kit | 25/100次 |
R7018S | T7 High Yield RNA Transcription Kit | 25次 |
R7018M | T7 High Yield RNA Transcription Kit | 100次 |
R7020S | SP6 High Yield RNA Transcription Kit | 25次 |
R7020M | SP6 High Yield RNA Transcription Kit | 100次 |
R7061S | Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) | 20次 |
R7061M | Biotin RNA Labeling Kit (SP6/T7) | 100次 |
R7063S | Biotin RNA Labeling Kit (T3/T7) | 20次 |
R7063M | Biotin RNA Labeling Kit (T3/T7) | 100次 |
R0102-2kU | RNase Inhibitor | 2000U |
R0102-10kU | RNase Inhibitor | 10000U |
R0102-50kU | RNase Inhibitor | 50000U |
R0123 | RNase and DNase Away | 250ml |
R0125 | RNase, DNase and DNA Away | 250ml |
R0127 | RNase, DNase, RNA and DNA Away | 250ml |
ST351 | 3M NaAc, pH5.2 (Sterile, DNase free) | 100ml |
R0107 | 氧钒核糖核苷复合物(RNase抑制剂) | 2ml |
R0108 | 氧钒核糖核苷复合物(RNase抑制剂) | 10ml |
R7070S | E.coli Poly(A) Polymerase | 100U |
R7070M | E.coli Poly(A) Polymerase | 500U |
R7070L | E.coli Poly(A) Polymerase | 2.5KU |
R7070XL | E.coli Poly(A) Polymerase | 10KU |
R7075S | Poly(A) Polymerase Tailing Kit | 50-250次 |
R0021 | DEPC水(DNase、RNase free) | 100ml |
R0022 | DEPC水(DNase、RNase free) | 500ml |
ST1249-2ml | DEPC (≥97%, Reagent grade) | 2ml |
ST1249-10ml | DEPC (≥97%, Reagent grade) | 10ml |
ST876-100ml | BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) | 100ml |
ST876-500ml | BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) | 500ml |
ST041-2ml | 0.5M DTT (DNase, RNase & Protease free) | 2ml |
ST041-10ml | 0.5M DTT (DNase, RNase & Protease free) | 10ml |
ST004L | Agarose | 50g |
ST004M | Agarose (Low EEO) | 50g |
ST004Q | Agarose (Low EEO) | 250g |
ST105 | Agarose (Low Melting Point) | 1/5/25/100g |
ST066 | 0.5M EDTA, pH8.0 | 100ml |
ST498-100ml | 8M LiCl (DNase/RNase free) | 100ml |
P0101 | 生物素检测封闭试剂盒 | 200次 |
FFN13 | 尼龙膜(带正电荷, 进口分装, 15×16.5cm, 0.45μm) | 5张/包装 |