XRN-1
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产品编号 R7040S
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¥ 428.00
产品包装:
20U 100U 500U
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碧云天生产的XRN-1,又称5’-Phosphate Dependent Exonuclease (5’-磷酸依赖的核酸外切酶)。它是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台通过大肠杆菌表达、纯化获得的一种高活性的5’-3’核糖核酸外切酶(5’-3’ Exoribonucleases),并要求底物RNA的5’端为单磷酸修饰,是一种可用于催化5’端单磷酸化RNA (p-RNA)以5’→3’方向降解为NMP的5’核酸外切酶。XRN-1也可以消化具有5’端单磷酸化的单链DNA (ssDNA),但酶切效率较低[1]。XRN-1不能消化具有5’端三磷酸(5’-ppp)、5’端二磷酸(5’-pp)、5’加帽(5’-cap)和5’端羟基(5’-OH)的RNA、双链DNA (dsDNA) 和5’端为羟基、三磷酸或二磷酸的单链DNA,XRN-1也不能消化5’磷酸末端凹陷的双链RNA、DNA与RNA杂合链或形成类似二级结构中的5’磷酸RNA [1-3]。XRN-1发挥活性需要Mg2+ [3],其催化的反应如下:

p-RNA → NMP

XRN-1的酶学性质使得其可以被应用于选择性消化核糖体RNA (rRNA),在不依赖于oligo-dT磁珠或琼脂糖凝胶的情况下,可以从总RNA中分离和富集信使RNA (mRNA),以便于构建mRNA测序文库[4]。XRN-1也可以用于RNA的5’末端分析等。

碧云天XRN-1水解5’端单磷酸化RNA的荧光实时分析请参考图1。

图1. 碧云天XRN-1 (R7040)与国外L公司(Competitor L)的XRN-1对5'端单磷酸化RNA水解效果对比图。图A,发光原理。分别合成带有荧光基团的单链RNA-FAM和单链DNA-TAMRA,通过退火得到RNA/DNA杂交链[5],TAMRA由于靠近FAM基团,可猝灭FAM的荧光。随着XRN-1消化RNA,FAM从从退火的双链寡核苷酸中释放,并在520nm波长处可检测到FAM荧光。图B,荧光法活性检测。配制100μl反应体系:50mM Tris-HCl (pH8.0),100mM NaCl,2mM MgCl2,20U RNase Inhibitor (R0102),250nM底物RNA/DNA,0或20nM XRN-1。检测条件:激发波长494nm,发射波长520nm,温度30ºC,每10秒检测一次,共检测200秒。碧云天与L公司的XRN-1相比,图中对5’端单磷酸化RNA的水解效果更优。图中数据仅供参考,不同实验条件下获得的数据会有一定的差异。

碧云天XRN-1对哺乳动物细胞中提取的总RNA中rRNA的水解效果请参考图2。

图2. 碧云天XRN-1 (R7040)对哺乳动物细胞总RNA中rRNA的水解效果图。反应体系为20μl,总RNA含量为1μg,XRN-1为1μl,反应条件为30ºC孵育120分钟,反应完毕后加入2X RNA Loading Buffer (R0215)终止反应,随后取20μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示,1μl XRN-1在30ºC条件下,120分钟可以消化95%以上的rRNA。碧云天与L公司的XRN-1相比,对rRNA的水解效果基本一致。图中数据仅供参考,不同实验条件下获得的数据会有一定的差异。

来源:由大肠杆菌表达,表达基因为酵母的XRN-1基因。

分子量:约175kDa。

活性定义:One unit digests 1μg of rRNA substrate into acid-soluble nucleotides in 60 minutes at 30ºC under standard assay conditions。

纯度:不含自身活性之外的RNA酶,不含自身活性之外的DNA内切酶和外切酶。

Storage (Dilution) Buffer: 20mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% Glycerol.

10X Reaction Buffer: 500mM Tris-HCl (pH8.0), 1M NaCl, 20mM MgCl2.

失活或抑制:反应体系中超过1mM EDTA会对XRN-1的酶活造成抑制[3]。此外,70ºC孵育10分钟可使XRN-1失活。RNase Inhibitor例如碧云天生产的R0102不会抑制其酶活性。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R7040S-1 XRN-1 (1U/μl) 20μl
R7040S-2 10X Reaction Buffer 200μl
R7040S-3 Storage (Dilution) Buffer 200μl
- 说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7040M-1 XRN-1 (1U/μl) 100μl
R7040M-2 10X Reaction Buffer 1ml
R7040M-3 Storage (Dilution) Buffer 1ml
- 说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
R7040L-1 XRN-1 (1U/μl) 500μl
R7040L-2 10X Reaction Buffer 5ml
R7040L-3 Storage (Dilution) Buffer 5ml
- 说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,至少两年有效。

注意事项:

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
Reagent Control Sample
Volume Conc. or amount Volume Conc. or amount
Ultrapure Water (16.5-X)μl - (16.5-X)μl -
10X Reaction Buffer 2μl 1X 2μl 1X
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl 20U 0.5μl 20U
RNA Sample Xμl 1μg Xμl 1μg
Storage (Dilution) Buffer 1μl - - -
XRN-1 (1U/μl) - - 1μl 1U
Total volume 20μl - 20μl -
注1:由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂与耗材需要确保是RNase free的。
注2:Ultrapure Water推荐使用碧云天的ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。RNase Inhibitor推荐使用碧云天的R0102
注3:该反应体系中RNase Inhibitor不会抑制XRN-1,添加是为了防止非特异性RNA降解。
注4:EDTA过多会抑制XRN-1活性,因此,不能使用TE等含有EDTA的缓冲液溶解RNA样品,反应底物RNA样品溶解在RNase free Ultrapure Water中即可;同时,该反应体系对RNA样品的纯度与质量要求较高,否则会影响消化反应结果。
注5:若需彻底水解5'端三磷酸化转录本,可额外添加RNA 5' Pyrophosphohydrolase (RppH) (R7035)。
2. 反应条件:30ºC孵育60分钟。如果发现效果欠佳,可以适当延长孵育时间至2-6小时。
3. 孵育完成后,按照1:1比例加入2X RNA Loading Buffer (R0215)混匀,根据核酸片段大小选择1.5%琼脂糖凝胶或者15%尿素(7M)聚丙烯酰胺变性胶进行电泳鉴定。
参考文献:
1. Stevens A, Poole TL. J Biol Chem. 1995. 270(27):16063-9.
2. Furuichi Y, LaFiandra A, Shatkin AJ. Nature. 1977. 266(5599):235-9.
3. Langeberg CJ, Welch WRW, McGuire JV, Ashby A, Jackson AD, et al. Biochemistry. 2020. 59(15):1493-1507.
4. Mironov KS, Shumskaya M, Los DA. Biochimie. 2020. 177:63-67.
5. Sinturel F, Pellegrini O, Xiang S, Tong L, Condon C, et al. RNA. 2009. 15(11):2057-62.
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