碧云天研发生产的Recombinant Human FTO Protein (EC 1.14.11.53)，也称Fat Mass and Obesity-associated Protein (FTO)，中文名为脂肪量和肥胖相关蛋白，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种RNA去甲基酶。FTO属于α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate, α-KG)和Fe(II)依赖的双加氧酶(Dioxygenase)家族，可以有效去除单链RNA的m6A甲基化修饰[1, 2]，还可以催化ssRNA中3-甲基尿嘧啶(m3U)和ssDNA中3-甲基胸腺嘧啶(m3T)的氧化去甲基化[3]。FTO对单链核酸具有偏好性，更倾向于ssDNA/RNA作为底物，首选底物是甲基化的RNA [4]。

FTO对ssDNA/RNA的m6A去甲基化的反应原理如下。FTO在体外以α-酮戊二酸和Fe(II)依赖的方式催化m6A去甲基化时，先将α-酮戊二酸转化为琥珀酸(Succinate)和CO2，生成不稳定的羟甲基，羟甲基再分裂成甲醛和去甲基化碱，并进一步转化为腺苷(Adenosine) [5]。

图1.FTO催化ssDNA/RNA的m6A去甲基化的反应图。

FTO基因仅存在于脊椎动物和海藻中，在脊椎动物的下丘脑、垂体和肾上腺中高表达[3, 6]，FTO蛋白定位于细胞核中[7]。FTO与一系列代谢和神经退行性疾病包括肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎和阿尔茨海默症等密切相关[8]；FTO内的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphisms, SNPs)与肥胖以及子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤等癌症有关。此外，FTO还有具有调节脂肪生成的作用；多种癌症疾病包括急性髓性白血病、胶质母细胞瘤、宫颈鳞状细胞癌和黑色素瘤等都与FTO和m6A修饰失调相关[9]，因此FTO成为许多癌症精准医学的潜在靶点。

碧云天Recombinant Human FTO Protein去除ssDNA的m6A甲基化修饰的效果参考图2。

图2.碧云天Recombinant Human FTO Protein (R0649)对ssDNA的m6A修饰的去甲基化效果图。在20µl反应体系中，加入3µM的ssDNA和0/0.63/1.25/2.5µM FTO，25ºC孵育2小时。孵育结束后，取2.2µl (100ng ssDNA)反应产物滴至尼龙膜上，待样品风干后，进行紫外交联，然后用Wash Buffer洗涤3分钟，再用Blocking Buffer室温封闭2-3小时，之后将膜转移至N6-Methyladenosine (m6A) Rabbit Polyclonal Antibody (AF7407)中，4ºC孵育过夜。次日，用Wash Buffer室温洗涤4次，每次5分钟；随后将尼龙膜浸泡在适当稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)溶液中，室温孵育1小时。然后用Wash Buffer室温洗涤4次，每次5分钟；最后用BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒) (P0018A)进行化学发光，并使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统记录化学发光效果。实验结果如图2所示，3µM的ssDNA用2.5µM FTO处理2小时，可以基本去除其中的m6A甲基化。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

用途：适用于FTO酶动力学、抑制剂筛选和选择性分析。

来源：大肠杆菌表达的人源FTO基因。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

酶储存溶液：150mM NaCl, 50% (v/v) Glycerol, 50mM HEPES (pH8.0 @ 25ºC).

失活或抑制：加入5mM EDTA，随后95ºC处理5分钟。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0649S-1	Recombinant Human FTO Protein (1mg/ml)	50µl
R0649S-2	Reaction Buffer I (10X)	250µl
R0649S-3	Reaction Buffer II (10X)	250µl
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R0649M-1	Recombinant Human FTO Protein (1mg/ml)	200µl
R0649M-2	Reaction Buffer I (10X)	1ml
R0649M-3	Reaction Buffer II (10X)	1ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，至少一年有效。

注意事项：

本产品使用时宜放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

由于涉及RNA和DNA操作，须严格按照RNA和DNA操作的规范进行，避免RNase和DNase污染。

实验中用到的吸头、离心管等实验耗材必须为RNase和DNase free的或须经DEPC处理，推荐选购碧云天的BeyoGold™系列中无RNase和DNase污染的耗材产品。不含RNase和DNase的超纯水推荐使用碧云天的BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)或DEPC水(DNase、RNase free) (R0021/R0022)。

桌面等环境以及仪器设备表面的RNase、DNase、RNA和DNA的去除推荐使用碧云天的RNase, DNase, RNA and DNA Away (R0127)进行快速处理。

可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如RNase Inhibitor、超纯水等。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.Recombinant Human FTO Protein对ssDNA/RNA的N 6-methyladenosine (m6A) 去甲基化反应体系的设置。参考下表在冰浴中配制如下反应体系。

Reagent	Volume	Final Concentration
Nuclease-Free Water	(15.4-x)µl	-
Reaction Buffer I (10X)	2µl	1X
Reaction Buffer II (10X)	2µl	1X
ssDNA/RNA (100µM)	0.6µl (60pmol)	3µM
Recombinant Human FTO Protein (1mg/ml)	xµl	≥0.136mg/ml (2.5µM)
Total Volume	20µl	-

注1：如果只进行一个反应，请把除Recombinant Human FTO Protein (1mg/ml)以外的组分充分混匀后，再加入Recombinant Human FTO Protein (1mg/ml)；如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssDNA/RNA之外的所有溶液和酶提前预混合后分装到各反应管内，再加入ssDNA/RNA，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀，或用Vortex在最低速度轻轻混匀)后低速离心沉淀液体。
注2：本反应体系中涉及单链RNA，推荐适量添加RNase Inhibitor, Murine (R0101)、RNase Inhibitor (R0102)、RNase Inhibitor Plus, Human Placenta (R0105)或RNase Inhibitor, Human Placenta (R0106)。
注3：实际使用过程中，如果希望去甲基化程度更加充分，可以适当增加FTO的用量。
2.甲基化反应：25ºC孵育2小时。随后可直接通过点杂交等进行检测。
3.(可选)终止反应：加入5mM EDTA，随后95ºC处理5分钟即可终止反应。
4.其它用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。
参考文献：
1.Zhang M, Zhang Y, Ma J, Guo F, Cao Q, et al. PLoS One. 2015. 10(7):e0133788.
2.Huang M, Guo J, Liu L, Jin H, Chen X, et al. Front Cell Dev Biol. 2023. 11:1275475.
3.Jia G, Yang CG, Yang S, Jian X, Yi C, et al. FEBS Lett. 2008. 582(23-24):3313-9.
4.Jia G, Fu Y, Zhao X, Dai Q, Zheng G, et al. Nat Chem Biol. 2011. 7(12):885-7.
5.Zou S, Toh JD, Wong KH, Gao YG, Hong W, et al. Sci Rep. 2016. 6:25677.
6.Robbens S, Rouzé P, Cock JM, Spring J, Worden AZ, et al. J Mol Evol. 2008. 66(1):80-4.
7.Gerken T, Girard CA, Tung YC, Webby CJ, Saudek V, et al. Science. 2007. 318(5855):1469-72.
8.Cheong A, Low JJA, Lim A, Yen PM, Woon ECY. Chem Sci. 2018. 9(36):7174-7185.
9.Azzam SK, Alsafar H, Sajini AA. Int J Mol Sci. 2022. 23(7):3800.
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产品编号	产品名称	包装
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