BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法)
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产品编号 R0085S
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¥ 698.00
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碧云天研发生产的BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法) (BeyoMag™ Paraffin-embedded Tissue RNA Purification Kit with Magnetic Beads),也称石蜡包埋组织总RNA抽提试剂盒(磁珠法)、石蜡包埋组织RNA提取试剂盒(磁珠法)、FFPE组织切片RNA抽提试剂盒(磁珠法)等,是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后抽提切片中总RNA的试剂盒。抽提获得的RNA包含大分子量RNA和小RNA (<200nt),也常被称为总RNA (Total RNA),可用于反转录、qRT-PCR或转录组测序等下游实验。

本试剂盒也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA抽提。

福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixation and paraffin embedding, FFPE),常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构,以便于运输和储存,是病理样品长期保存的主要方法之一[1]。组织样品经福尔马林固定时,组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联,核酸出现片段化,因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡,以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的RNA分子,最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中RNA与其它分子交联的不利影响,经本试剂盒抽提获得的RNA纯度高、完整性好、质量稳定。

本试剂盒抽提RNA的实验流程如图1所示。首先使用环保的脱蜡剂和蛋白酶K将FFPE样品脱蜡、消化,释放出来的RNA在特定条件下与磁珠特异性结合。在外界磁场(如磁分离架)的作用下,磁珠与相应溶液可以快速高效地分离。随后通过四次洗涤去除各种杂质,最后通过洗脱液把RNA洗脱下来。

图1.碧云天BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法) (R0085)的实验流程图。

本试剂盒抽提获得的石蜡包埋组织样品总RNA纯度高。抽提获得的RNA A260/A280的范围通常在1.7-1.9之间。本试剂盒与同类产品的抽提效果对比图参见图2。

图2.碧云天BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法) (R0085)与M品牌同类产品(Competitor M)的RNA抽提效果对比图。样品为小鼠肝脏和肾脏组织石蜡切片,样品用量为6片10μm厚切片。抽提后洗脱体积均为100μl,取10μl的洗脱样品与2μl BeyoRed DNA上样缓冲液(6X) (D0072)混合均匀后,在1%琼脂糖凝胶中电泳30分钟后拍照。如图所示,本试剂盒用于抽提小鼠肝脏、肾脏FFPE样品的RNA时,抽提得到的RNA的量优于M品牌的同类试剂盒。注:抽提得到的RNA经DNase I处理。实际结果会因样品、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒使用安全、高效。本试剂盒通过特殊的磁珠进行RNA分离纯化,能有效避免常规方法抽提RNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。

本试剂盒操作快速、便捷。本试剂盒采用磁珠纯化,无需繁琐的RNA沉淀步骤,纯化RNA操作过程仅需约15-20分钟即可完成。和国外同类磁珠纯化产品相比,所需操作步骤和操作时间基本一致。碧云天同时提供RNAeasy™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(离心柱式) (R0033),而磁珠法抽提得到的RNA包含<200nt的小RNA或部分降解、断裂RNA,抽提更完全。

本试剂盒的标准操作步骤抽提得到的总RNA含有少量DNA,但如果按照可选步骤加入DNase,就可以获得不含DNA的高纯度总RNA。

本试剂盒小包装可用于50个样品的总RNA抽提。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0085S-1 脱蜡剂 50ml
R0085S-2 裂解液 10ml
R0085S-3 结合液 11ml
R0085S-4 洗涤液I (首次使用前加34ml无水乙醇) 26ml (+34ml)
R0085S-5 洗涤液II (首次使用前加39ml无水乙醇) 26ml (+39ml)
R0085S-6 洗脱液 12ml
R0085S-7 蛋白酶K 600μl
R0085S-8 BeyoMag™ RNA磁珠 1ml
R0085S-9 DNase 100μl
R0085S-10 Reaction Buffer (10X) 500μl
说明书 1份
保存条件:

蛋白酶K、DNase和Reaction Buffer (10X) -20ºC保存,其余均室温保存,一年有效。其中,BeyoMag™ RNA磁珠长期不使用时,可以4ºC保存,4ºC可以保存更长时间。蛋白酶K室温(15-25ºC)存放一周,活力无明显下降。

注意事项:

如果希望获得更高质量的RNA,宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4-10%福尔马林中固定,固定时间最好在8-24小时之间或更短时间,长时间固定会使RNA断裂更为严重。

样品包埋前应确保彻底脱水,残留的甲醛可能抑制蛋白酶K的消化等相关实验步骤。

本试剂盒抽提RNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长(>1年)易破坏RNA完整性,无法抽提出长片段。

石蜡包埋组织抽提得到的RNA,由于样品的特殊性,存在可能的断裂或降解,通常不建议用于需要全长RNA的下游应用。

温度较低时裂解液或结合液中可能会有沉淀产生,属正常现象。使用前必须检查一遍,如有沉淀,55ºC水浴孵育使沉淀溶解,混匀后使用。

第一次使用前小包装洗涤液I需添加34ml无水乙醇,洗涤液II需添加39ml无水乙醇,混匀,并在瓶上做好标记。

本试剂盒须将FFPE样品56ºC和80ºC孵育,推荐使用碧云天的BeyoBath™干式恒温金属浴(1.5/2ml×40) (E6662)。

使用本试剂盒须提前备好无水乙醇和异丙醇。

除特别说明外,每次Vortex应控制在5-10秒左右,推荐使用碧云天的BeyoVortex™调速式涡旋混匀仪(E6699)或BeyoVortex™基础型涡旋混匀仪(E6788)。

如果不使用试剂盒提供的DNase进行处理,本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量DNA。后续如进行某些对DNA残留敏感的实验时,需要在使用说明步骤3b后,在磁珠中加入适量DNase进行消化,具体请参考使用说明。如果基因组DNA消化不充分,可以加大DNase的用量或延长孵育时间。DNase用量如果需要加大,可以考虑订购碧云天的RNase-free的DNase I (D7073/D7076)。

本试剂盒需自备磁分离装置,推荐使用碧云天的1.5/2ml磁分离架(FMS004/FMS008/FMS012/FMS016/FMS024)。

磁珠在静置后会发生沉降,使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。

磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象,可以在磁珠聚集后晃动管内液体,使挂壁的磁珠流下。

请使用推荐的样品量。如果样品量过大,可能造成磁珠聚集,会影响洗涤进而影响抽提获得的RNA纯度。发生磁珠聚集时,洗涤时需尽量分散磁珠,这样可有效改善抽提效果。如果发生磁珠聚集现象,建议在后续实验中适当减少样品用量。

本试剂盒提供的所有试剂都是RNase-free,操作时应小心,避免被RNase污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果耗材可能有RNase污染,可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后高温高压灭菌烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话,以防RNase污染。建议戴一次性口罩。

对于操作环境中RNA酶的去除,推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.样品处理。
a.石蜡包埋组织切片:取2-8张的石蜡切片(5-10μm厚,表面积小于1×1cm2)。
如果样品表面暴露于空气中,尽量避免使用。
b.福尔马林固定组织:取10-25mg福尔马林固定液中的组织,用手术刀充分切碎后,置于1.5ml离心管中,加入500μl的PBS, pH7.4 (DNase, RNase & Protease free, Sterile) (ST478),Vortex震荡混匀,12,000×g离心1分钟后充分去除上清,再重复清洗2次,然后从步骤2h开始操作。
2.脱蜡和裂解。
a.将石蜡切片置于1.5ml离心管中,加入600μl的脱蜡剂,剧烈Vortex 30秒,以充分脱蜡。
福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂,直接转入步骤2h开始操作;如果石蜡样品过多,可以将脱蜡剂用量增加至1ml。
b.室温,≥14,000×g离心5分钟。
c.使用吸头小心吸去上清,注意不要碰到沉淀。
d.加入1ml无水乙醇,Vortex混匀。
e.室温,≥14,000×g离心5分钟。
f.使用吸头小心吸去上清,注意不要碰到沉淀。
可以用新的10μl吸头小心吸去残留的乙醇,有利于乙醇挥发。
g.打开管盖,室温放置5-10分钟直至残留的乙醇完全挥发。
残留的乙醇会对RNA产生影响,可以将离心管置于37ºC环境下挥发乙醇。
h.加入150μl裂解液和10μl蛋白酶K,Vortex混匀,56ºC金属浴或水浴孵育15分钟或直至样品完全裂解。
i.将完全裂解的组织样本置于80ºC孵育15分钟,之后短暂离心使管盖上的蒸发液体回到管中。
80ºC孵育对修复RNA变形解交联至关重要,但是必须严格控制孵育的温度和时间,否则可能产生更多的RNA碎片,因此应先将金属浴或水浴加温至80ºC再放入样本进行孵育。
j.室温,14,000×g离心5分钟,转移上清液(150μl)至新的离心管中,注意不要碰到沉淀。
k.向上述新的离心管中加入200μl结合液,Vortex混匀;再加入300μl异丙醇,Vortex混匀。
加入结合液和异丙醇后可能会产生白色沉淀,需立即Vortex混匀彻底混匀,但不会干扰后续实验。
3.纯化RNA。
a.向步骤2k中的混合物加入20µl BeyoMag™ RNA磁珠悬液(使用前务必混匀),轻柔混匀后,室温放置3-5分钟。将离心管置于磁力架的磁场中,待磁珠完全聚集后,小心吸除残液。
磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要,可适当增加磁珠用量,延长结合时间以提高得率。
b.加入500µl洗涤液I,轻柔震荡使磁珠分散开,颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中,待磁珠完全聚集后,尽量吸净残液。
c.选做:如果略去本步骤,通过本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量基因组DNA。后续如进行某些对基因组DNA残留较敏感的实验时,可在上一步骤洗涤后,在磁珠中加入80µl含2μl DNase的酶溶液(每80µl酶溶液按照70µl水加8µl Reaction Buffer (10X)再加2µl DNase混合配制而成),37℃震荡消化15分钟。消化结束后,不需要任何额外操作,直接进入步骤3d。
d.加入500µl洗涤液I,轻柔震荡使磁珠分散开,颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中,待磁珠完全聚集后,尽量吸净残液。
e.加入600µl洗涤液II,轻柔震荡使磁珠分散开,颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中,待磁珠完全聚集后,尽量吸净残液。
f.重复步骤3e一次。
g.将离心管室温放置5-10分钟,或置于37ºC烘箱5分钟,确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
h.加入50-100μl洗脱液,轻柔震荡使磁珠悬于溶液中,室温孵育3-5分钟,其间甩动离心管1-2次。将离心管置于磁场中,待磁珠完全聚集后,小心吸取溶液至新离心管中,置于-20ºC保存。所得溶液即为纯化的总RNA。
注1:如果有必要,可以使用超纯水洗脱RNA,洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响,使用超纯水洗脱时应保证其pH值在7.0-8.5之间。推荐BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。
注2:如需获得更高浓度的样品,可把洗脱液的体积减小至20µl,但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时,洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外,洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次,可提高得率约10-30%;或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次,会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。
参考文献:
1.Lee H, Ryu HS, Park HC, et al. Int J Mol Sci. 2022. 23(21):12923.
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