碧云天研发生产的BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法) (BeyoMag™ Paraffin-embedded Tissue RNA Purification Kit with Magnetic Beads)，也称石蜡包埋组织总RNA抽提试剂盒(磁珠法)、石蜡包埋组织RNA提取试剂盒(磁珠法)、FFPE组织切片RNA抽提试剂盒(磁珠法)等，是一种采用环保脱蜡方式去除石蜡后抽提切片中总RNA的试剂盒。抽提获得的RNA包含大分子量RNA和小RNA (<200nt)，也常被称为总RNA (Total RNA)，可用于反转录、qRT-PCR或转录组测序等下游实验。

本试剂盒也可以用于福尔马林、多聚甲醛等固定的组织的RNA抽提。

福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixation and paraffin embedding, FFPE)，常应用于癌症等疾病研究中保存离体组织的形态学和组织学结构，以便于运输和储存，是病理样品长期保存的主要方法之一[1]。组织样品经福尔马林固定时，组织内细胞中的核酸和蛋白质等分子间随机交联，核酸出现片段化，因此难以获得高质量核酸。本试剂盒采用环保脱蜡法去除石蜡，以特殊的裂解条件释放FFPE组织样本中的RNA分子，最大程度地降低了福尔马林固定时组织内细胞中RNA与其它分子交联的不利影响，经本试剂盒抽提获得的RNA纯度高、完整性好、质量稳定。

本试剂盒抽提RNA的实验流程如图1所示。首先使用环保的脱蜡剂和蛋白酶K将FFPE样品脱蜡、消化，释放出来的RNA在特定条件下与磁珠特异性结合。在外界磁场(如磁分离架)的作用下，磁珠与相应溶液可以快速高效地分离。随后通过四次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把RNA洗脱下来。

图1.碧云天BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法) (R0085)的实验流程图。

本试剂盒抽提获得的石蜡包埋组织样品总RNA纯度高。抽提获得的RNA A260/A280的范围通常在1.7-1.9之间。本试剂盒与同类产品的抽提效果对比图参见图2。

图2.碧云天BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法) (R0085)与M品牌同类产品(Competitor M)的RNA抽提效果对比图。样品为小鼠肝脏和肾脏组织石蜡切片，样品用量为6片10μm厚切片。抽提后洗脱体积均为100μl，取10μl的洗脱样品与2μl BeyoRed DNA上样缓冲液(6X) (D0072)混合均匀后，在1%琼脂糖凝胶中电泳30分钟后拍照。如图所示，本试剂盒用于抽提小鼠肝脏、肾脏FFPE样品的RNA时，抽提得到的RNA的量优于M品牌的同类试剂盒。注：抽提得到的RNA经DNase I处理。实际结果会因样品、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒使用安全、高效。本试剂盒通过特殊的磁珠进行RNA分离纯化，能有效避免常规方法抽提RNA时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。

本试剂盒操作快速、便捷。本试剂盒采用磁珠纯化，无需繁琐的RNA沉淀步骤，纯化RNA操作过程仅需约15-20分钟即可完成。和国外同类磁珠纯化产品相比，所需操作步骤和操作时间基本一致。碧云天同时提供RNAeasy™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(离心柱式) (R0033)，而磁珠法抽提得到的RNA包含<200nt的小RNA或部分降解、断裂RNA，抽提更完全。

本试剂盒的标准操作步骤抽提得到的总RNA含有少量DNA，但如果按照可选步骤加入DNase，就可以获得不含DNA的高纯度总RNA。

本试剂盒小包装可用于50个样品的总RNA抽提。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0085S-1	脱蜡剂	50ml
R0085S-2	裂解液	10ml
R0085S-3	结合液	11ml
R0085S-4	洗涤液I (首次使用前加34ml无水乙醇)	26ml (+34ml)
R0085S-5	洗涤液II (首次使用前加39ml无水乙醇)	26ml (+39ml)
R0085S-6	洗脱液	12ml
R0085S-7	蛋白酶K	600μl
R0085S-8	BeyoMag™ RNA磁珠	1ml
R0085S-9	DNase	100μl
R0085S-10	Reaction Buffer (10X)	500μl
—	说明书	1份

保存条件：

蛋白酶K、DNase和Reaction Buffer (10X) -20ºC保存，其余均室温保存，一年有效。其中，BeyoMag™ RNA磁珠长期不使用时，可以4ºC保存，4ºC可以保存更长时间。蛋白酶K室温(15-25ºC)存放一周，活力无明显下降。

注意事项：

如果希望获得更高质量的RNA，宜尽量使用新鲜固定和包埋的组织样品。拿到组织样品后尽快在4-10%福尔马林中固定，固定时间最好在8-24小时之间或更短时间，长时间固定会使RNA断裂更为严重。

样品包埋前应确保彻底脱水，残留的甲醛可能抑制蛋白酶K的消化等相关实验步骤。

本试剂盒抽提RNA依赖于样品类型、储存时间以及固定条件。样品固定时间和保存时间过长(＞1年)易破坏RNA完整性，无法抽提出长片段。

石蜡包埋组织抽提得到的RNA，由于样品的特殊性，存在可能的断裂或降解，通常不建议用于需要全长RNA的下游应用。

温度较低时裂解液或结合液中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍，如有沉淀，55ºC水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。

第一次使用前小包装洗涤液I需添加34ml无水乙醇，洗涤液II需添加39ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。

本试剂盒须将FFPE样品56ºC和80ºC孵育，推荐使用碧云天的BeyoBath™干式恒温金属浴(1.5/2ml×40) (E6662)。

使用本试剂盒须提前备好无水乙醇和异丙醇。

除特别说明外，每次Vortex应控制在5-10秒左右，推荐使用碧云天的BeyoVortex™调速式涡旋混匀仪(E6699)或BeyoVortex™基础型涡旋混匀仪(E6788)。

如果不使用试剂盒提供的DNase进行处理，本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量DNA。后续如进行某些对DNA残留敏感的实验时，需要在使用说明步骤3b后，在磁珠中加入适量DNase进行消化，具体请参考使用说明。如果基因组DNA消化不充分，可以加大DNase的用量或延长孵育时间。DNase用量如果需要加大，可以考虑订购碧云天的RNase-free的DNase I (D7073/D7076)。

本试剂盒需自备磁分离装置，推荐使用碧云天的1.5/2ml磁分离架(FMS004/FMS008/FMS012/FMS016/FMS024)。

磁珠在静置后会发生沉降，使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。

磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。

请使用推荐的样品量。如果样品量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响抽提获得的RNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善抽提效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少样品用量。

本试剂盒提供的所有试剂都是RNase-free，操作时应小心，避免被RNase污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩。

对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品处理。
a.石蜡包埋组织切片：取2-8张的石蜡切片(5-10μm厚，表面积小于1×1cm2)。
如果样品表面暴露于空气中，尽量避免使用。
b.福尔马林固定组织：取10-25mg福尔马林固定液中的组织，用手术刀充分切碎后，置于1.5ml离心管中，加入500μl的PBS, pH7.4 (DNase, RNase & Protease free, Sterile) (ST478)，Vortex震荡混匀，12,000×g离心1分钟后充分去除上清，再重复清洗2次，然后从步骤2h开始操作。
2.脱蜡和裂解。
a.将石蜡切片置于1.5ml离心管中，加入600μl的脱蜡剂，剧烈Vortex 30秒，以充分脱蜡。
福尔马林固定液中的组织样品无需加脱蜡剂，直接转入步骤2h开始操作；如果石蜡样品过多，可以将脱蜡剂用量增加至1ml。
b.室温，≥14,000×g离心5分钟。
c.使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
d.加入1ml无水乙醇，Vortex混匀。
e.室温，≥14,000×g离心5分钟。
f.使用吸头小心吸去上清，注意不要碰到沉淀。
可以用新的10μl吸头小心吸去残留的乙醇，有利于乙醇挥发。
g.打开管盖，室温放置5-10分钟直至残留的乙醇完全挥发。
残留的乙醇会对RNA产生影响，可以将离心管置于37ºC环境下挥发乙醇。
h.加入150μl裂解液和10μl蛋白酶K，Vortex混匀，56ºC金属浴或水浴孵育15分钟或直至样品完全裂解。
i.将完全裂解的组织样本置于80ºC孵育15分钟，之后短暂离心使管盖上的蒸发液体回到管中。
80ºC孵育对修复RNA变形解交联至关重要，但是必须严格控制孵育的温度和时间，否则可能产生更多的RNA碎片，因此应先将金属浴或水浴加温至80ºC再放入样本进行孵育。
j.室温，14,000×g离心5分钟，转移上清液(150μl)至新的离心管中，注意不要碰到沉淀。
k.向上述新的离心管中加入200μl结合液，Vortex混匀；再加入300μl异丙醇，Vortex混匀。
加入结合液和异丙醇后可能会产生白色沉淀，需立即Vortex混匀彻底混匀，但不会干扰后续实验。
3.纯化RNA。
a.向步骤2k中的混合物加入20µl BeyoMag™ RNA磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置3-5分钟。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
b.加入500µl洗涤液I，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
c.选做：如果略去本步骤，通过本试剂盒抽提得到的RNA会含有少量基因组DNA。后续如进行某些对基因组DNA残留较敏感的实验时，可在上一步骤洗涤后，在磁珠中加入80µl含2μl DNase的酶溶液(每80µl酶溶液按照70µl水加8µl Reaction Buffer (10X)再加2µl DNase混合配制而成)，37℃震荡消化15分钟。消化结束后，不需要任何额外操作，直接进入步骤3d。
d.加入500µl洗涤液I，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
e.加入600µl洗涤液II，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
f.重复步骤3e一次。
g.将离心管室温放置5-10分钟，或置于37ºC烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
h.加入50-100μl洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3-5分钟，其间甩动离心管1-2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20ºC保存。所得溶液即为纯化的总RNA。
注1：如果有必要，可以使用超纯水洗脱RNA，洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，使用超纯水洗脱时应保证其pH值在7.0-8.5之间。推荐BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。
注2：如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20µl，但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10-30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15-40%的RNA。
参考文献：
1.Lee H, Ryu HS, Park HC, et al. Int J Mol Sci. 2022. 23(21):12923.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
R0024	RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)	12次
R0026	RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)	50次
R0027	RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)	200次
R0028	RNAeasy™动物小RNA抽提试剂盒(离心柱式)	50次
R0032	RNAeasy™ Plus动物RNA抽提试剂盒(离心柱式)	50次
R0033S	RNAeasy™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(离心柱式)	50次
R0035	RNAeasy™病毒RNA抽提试剂盒(离心柱式)	12次/50次/200次
R0077	BeyoMag™磁珠法动物RNA抽提试剂盒	10次/50次/200次
R0091	RNAeasy™血液RNA抽提试剂盒(离心柱式)	12次/50次/200次
R0073	BeyoMag™磁珠法动物mRNA抽提试剂盒	50次/200次/800次
R0083	BeyoMag™磁珠法病毒RNA/DNA抽提试剂盒	10次/50次/200次
R0085S	BeyoMag™石蜡包埋组织RNA抽提试剂盒(磁珠法)	50次
ST533	Proteinase K (20mg/ml)	0.2ml/1ml/5ml
ST535	Proteinase K	100mg/500mg/2g
D7073	DNase I	200U
D7076	DNase I	1000U
ST975	环保脱蜡剂(二甲苯替代品)	50ml/250ml/1L
FMS012	BeyoMag™磁分离架(12孔)	1个/袋
FMS024	BeyoMag™磁分离架(24孔)	1个/袋
FMS004	BeyoMag™磁分离架(4孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS008	BeyoMag™磁分离架(8孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS016	BeyoMag™磁分离架(16孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS009	BeyoMag™磁分离架(8孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
FMS015	BeyoMag™磁分离架(16孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
FMS025	BeyoMag™磁分离架(24孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒