碧云天的BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅ Magnetic Beads (mRNA磁珠)，也称mRNA Magnetic Beads或Oligo dT磁珠(Oligo dT Magnetic Beads)，是一种使用Oligo (dT)₂₅包被的磁珠，可与mRNA等尾部的poly(A)互补配对，用于稳定、高效、便捷地直接从动物组织或培养的动物细胞中或从总RNA中快速分离纯化获得高纯度完整的带有poly(A)的mRNA等RNA的磁珠。

本产品纯化的带有poly(A)的mRNA、lncRNA等，可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、mRNA的m⁶A等修饰分析、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验，还可用于mRNA疫苗的研发，如mRNA疫苗的纯化、3' Poly A尾长度检测时Poly A尾短链的分离纯化等[1-2]。

本产品分离纯化的poly(A) RNA中也可包含带有poly(A)的lncRNA等，但通常主要为mRNA，因此也常被称为mRNA磁珠。

一个典型的哺乳动物细胞中，四种主要的大分子的质量和占比为：RNA, ∼20pg (1%); DNA, ~7pg (0.3%); protein, ∼500pg (20%); polysaccharide (多糖), ∼2μg (78.7%)。信使RNA (messenger RNA, 简称mRNA) 约占总RNA质量的4%，核糖体RNA (ribosomal RNA, 简称rRNA)约占80% [3]。

本产品的原理和主要操作流程如图1所示。BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)₂₅，当真核细胞、动植物组织的裂解液或抽提的总RNA与BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠混合后，磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA等3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合，然后在外界磁场的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，经洗涤充分去除杂质，最后用洗脱液将mRNA等从磁珠上洗脱下来，即可获得高纯度完整mRNA等带有poly(A)的RNA[4-5]。

图1.BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅ Magnetic Beads (mRNA磁珠) (R0075)用于mRNA抽提的工作原理示意图。

本产品盒具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点。本产品的mRNA提取体系经过反复测试和优化，能分离纯化获得总RNA中90%以上的mRNA，能从10⁶个细胞中抽提约0.1-1µg mRNA，20mg小鼠肝组织能抽提约0.2-2µg mRNA，20mg小鼠肺组织能抽提约0.1-1µg mRNA。仅需裂解、结合、洗涤、洗脱等简单的操作，整个纯化过程不超过15分钟即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成，操作便捷。提取的total RNA使用本产品进行mRNA的纯化效果参考图2。

图2.BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅ Magnetic Beads (mRNA磁珠) (R0075)用于从总RNA中纯化mRNA的效果图。使用RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式) (R0024)抽提293T细胞的总RNA，同时使用本产品进行mRNA的纯化，然后使用BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (D7268)进行qRT-PCR检测，使用Actin、B2M和GAPDH的三对内参引物对比总RNA (Total RNA)和纯化的mRNA的Ct值。图中可见mRNA纯化前后的Ct值基本一致，说明mRNA的纯化效果接近100%。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品磁珠粒径约为200nm，浓度约为5mg/ml。每毫克磁珠偶联的Oligo (dT)₂₅约为300-400pmol，每毫克磁珠可纯化约2-3µg mRNA等poly(A) RNA，即每毫升磁珠可以纯化约10-15µg mRNA等poly(A) RNA。

对于常规的mRNA纯化，按照每个样品使用20μl磁珠悬浊液，每1ml本磁珠可用于50次mRNA纯化。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0075-1ml	BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads	1ml
R0075-5ml	BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads	5ml
R0075-20ml	BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads	20ml
R0075-100ml	BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads	100ml
—	说明书	1份

保存条件：

4℃保存，一年有效。其中BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠长期不使用时，可以-20℃保存，-20℃可以保存更长时间。

注意事项：

操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

本产品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染，通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。

需自备磁分离装置，推荐使用碧云天的BeyoMag™磁分离架系列产品(FMS004、FMS008、FMS012、FMS016或FMS024)。

分装或使用磁珠时，请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。

磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。

请使用推荐的样本量。如果样本量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响提取获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少总样本量。

由于mRNA容易降解，提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用，需要-80℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.准备工作。
a.缓冲液的准备。根据实验需要配制相关缓冲液，参考配方如下配制：

Buffers	Recipe
Binding Buffer	20mM Tris-HCl (pH7.5), 1M LiCl, 2mM EDTA
Lysis Buffer	100mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 10mM EDTA,1% LiDS, 5mM DTT
Washing Buffer I	10mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM LiCl, 1mM EDTA, 0.1% LiDS
Washing Buffer II	10mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM LiCl, 1mM EDTA
Elution Buffer	10mM Tris-HCl (pH7.5)

注：试剂和耗材的RNase-free要求参见注意事项；试剂在使用时平衡至室温，如有沉淀，可37℃预热10分钟。
b.细胞样品的准备。
(a)贴壁细胞用PBS洗涤一次；悬浮细胞1000-2000×g室温离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次。
(b)按照细胞量加入推荐的裂解液。通过移液器吹打多次，裂解细胞至溶液变粘稠。
(c)选做：加入溶液裂解液后样品可能会比较粘稠，可适当超声或使用1ml注射器反复抽吸打断基因组DNA从而使粘稠感消失。此操作会产生泡沫，但不影响mRNA的得率。
(d)4℃以14,000×g离心5分钟，并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化，或保存在-80℃备用。
c.动物组织样品的准备。
(a)取所需量的动物组织，置于液氮中研磨成粉末，立即加入推荐量的裂解液。也可将组织置于1.5ml离心管中，迅速加入推荐量的冰浴预冷的裂解液，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。
(b)4℃以14,000×g离心5分钟，并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化，或保存在-80℃备用。
d.BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠的准备。
(a)将磁珠溶液从4℃冰箱取出，适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表，根据总RNA量和总细胞量或组织重量，取适量的BeyoMag™ Oligo (dT)₂₅磁珠悬液至一洁净离心管中。推荐使用BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, Nuclease free) (FTUB306)。

Total RNA	Beads required	Washing Buffer II
1~10µg	20µl	200µl each time
10~30µg	40µl	200µl each time
30-50µg	100µl	200µl each time

Cell number	Tissue mass	Lysis Buffer	Beads	Washing Buffer I	Washing Buffer Ⅱ
<5×105	<5mg	100µl	20µl	500µl	500µl each time
1~2×106	5~20mg	300µl	40µl	500µl	500µl each time
3~5×106	20~50mg	600µl	100µl	500µl	500µl each time

(b)无论磁珠用量多少，按照每个样品200µl结合液的量，加入适量结合液洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30秒，去除上清。重复本步骤1次。说明：如果样品数量超过5个，可以考虑将适量磁珠悬液先直接置于磁力架上分离30秒，去除上清，然后根据样品数量再加入适量结合液洗涤2次。
(c)按照每个样品100µl结合液的量，加入适量溶液结合液重悬磁珠。
2.从细胞或组织样品中分离纯化mRNA。
a.取上述制备好的细胞或组织样品与100µl洗涤后重悬的磁珠在室温下旋转混合5分钟 。
b.置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
c.室温下用500µl洗涤液I洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。
d.室温下用500µl洗涤液Ⅱ洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。重复本步骤1次。
e.根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：
(a)从磁珠上洗脱mRNA：加入10-20µl洗脱液或Nuclease-free的水，如DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)，75-80℃孵育2分钟，磁分离30秒，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。
注：建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80℃保存。
(b)如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用500µl洗涤液Ⅱ洗涤一次，再用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。
3.从Total RNA中纯化mRNA (以Total RNA的量为20µg为例)。
a.取100µl含有20µg Total RNA的样品与100µl结合液混合。注：如果20µg Total RNA不足100µl，可以用DEPC水或其它适当Nuclease-free溶液补足至100µl。
b.65ºC孵育2分钟以打开RNA的二级结构，孵育结束后迅速置于冰上。
c.将该200µl混合液与100µl洗涤后重悬的磁珠在室温下旋转混合5分钟。
d.置于磁力架上分离1分钟，去除上清。
e.室温下用200µl 洗涤液Ⅱ 洗涤磁珠，磁分离30秒，去上清。重复本步骤1次。
f.根据后续实验需求，进行mRNA的洗脱：
(a)从磁珠上洗脱mRNA：加入10-20µl洗脱液或Nuclease-free的水，如DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)，75-80℃孵育2分钟，磁分离30秒，然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中，置于冰上待用。
注：建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解，建议尽快进行后续实验。短时间内不使用，请置于-80℃保存。
(b)如果mRNA不洗脱直接用于后续实验，如固相cDNA文库构建等，用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次，即可用于后续实验。
参考文献：
1.Wommer L, Soerjawinata W, Ulber R, Kampeis P. Eng Life Sci. 2021. 21(10): 558–572.
2.Chaudhary N, Weissman D & Whitehead K A. Nat Rev Drug Discov. 2021.20, 817–838.
3.Wu J, Xiao J, Zhang Z, Wang X, Hu S, Yu J. Genomics Proteom Bioinforma. 2014. 12(2):57-63.
4.Michael R Green, Joseph Sambrook. Cold Spring Harb Protoc. 2019.10:711-714.
5.Nicholas M. Adams, Hali Bordelon, et al. ACS Applied Materials & Interfaces. 2015. 7(11):6062-6069.
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