BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads (mRNA磁珠)
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产品编号 R0075-5ml
数量
¥ 788.00
产品包装:
1ml 5ml 20ml 100ml
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碧云天的BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads (mRNA磁珠),也称mRNA Magnetic Beads或Oligo dT磁珠(Oligo dT Magnetic Beads),是一种使用Oligo (dT)25包被的磁珠,可与mRNA等尾部的poly(A)互补配对,用于稳定、高效、便捷地直接从动物组织或培养的动物细胞中或从总RNA中快速分离纯化获得高纯度完整的带有poly(A)的mRNA等RNA的磁珠。

本产品纯化的带有poly(A)的mRNA、lncRNA等,可直接应用于RT-PCR、qPCR、高通量测序、mRNA文库的构建、mRNA的m6A等修饰分析、固相cDNA文库构建、Northern blot分析、RACE等分子生物学实验,还可用于mRNA疫苗的研发,如mRNA疫苗的纯化、3' Poly A尾长度检测时Poly A尾短链的分离纯化等[1-2]。

本产品分离纯化的poly(A) RNA中也可包含带有poly(A)的lncRNA等,但通常主要为mRNA,因此也常被称为mRNA磁珠。

一个典型的哺乳动物细胞中,四种主要的大分子的质量和占比为:RNA, ∼20pg (1%); DNA, ~7pg (0.3%); protein, ∼500pg (20%); polysaccharide (多糖), ∼2μg (78.7%)。信使RNA (messenger RNA, 简称mRNA) 约占总RNA质量的4%,核糖体RNA (ribosomal RNA, 简称rRNA)约占80% [3]。

本产品的原理和主要操作流程如图1所示。BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠表面共价修饰了25聚dT序列即Oligo (dT)25,当真核细胞、动植物组织的裂解液或抽提的总RNA与BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠混合后,磁珠表面的寡聚dT序列与mRNA等3'端的poly(A)进行碱基配对而特异性结合,然后在外界磁场的作用下,磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离,经洗涤充分去除杂质,最后用洗脱液将mRNA等从磁珠上洗脱下来,即可获得高纯度完整mRNA等带有poly(A)的RNA[4-5]。

图1.BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads (mRNA磁珠) (R0075)用于mRNA抽提的工作原理示意图。

本产品盒具有提取效果稳定、纯度高、速度快、操作便捷等优点。本产品的mRNA提取体系经过反复测试和优化,能分离纯化获得总RNA中90%以上的mRNA,能从106个细胞中抽提约0.1-1µg mRNA,20mg小鼠肝组织能抽提约0.2-2µg mRNA,20mg小鼠肺组织能抽提约0.1-1µg mRNA。仅需裂解、结合、洗涤、洗脱等简单的操作,整个纯化过程不超过15分钟即可完成。所有操作都在同一个离心管中完成,操作便捷。提取的total RNA使用本产品进行mRNA的纯化效果参考图2。

图2.BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads (mRNA磁珠) (R0075)用于从总RNA中纯化mRNA的效果图。使用RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式) (R0024)抽提293T细胞的总RNA,同时使用本产品进行mRNA的纯化,然后使用BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (D7268)进行qRT-PCR检测,使用Actin、B2M和GAPDH的三对内参引物对比总RNA (Total RNA)和纯化的mRNA的Ct值。图中可见mRNA纯化前后的Ct值基本一致,说明mRNA的纯化效果接近100%。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本产品磁珠粒径约为200nm,浓度约为5mg/ml。每毫克磁珠偶联的Oligo (dT)25约为300-400pmol,每毫克磁珠可纯化约2-3µg mRNA等poly(A) RNA,即每毫升磁珠可以纯化约10-15µg mRNA等poly(A) RNA。

对于常规的mRNA纯化,按照每个样品使用20μl磁珠悬浊液,每1ml本磁珠可用于50次mRNA纯化。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0075-1ml BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads 1ml
R0075-5ml BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads 5ml
R0075-20ml BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads 20ml
R0075-100ml BeyoMag™ Oligo (dT)25 Magnetic Beads 100ml
说明书 1份
保存条件:

4℃保存,一年有效。其中BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠长期不使用时,可以-20℃保存,-20℃可以保存更长时间。

注意事项:

操作过程要严格保证无RNA酶和DNA酶污染。对于操作环境中RNase的去除,推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。

本产品的所用试剂和耗材都要求是RNase-free和DNase-free的,操作时应小心,避免被污染。如果耗材可能有RNase污染,可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后高温高压灭菌并烘干。如果可能有DNase污染,通常高温高压灭菌可以使DNase灭活。

需自备磁分离装置,推荐使用碧云天的BeyoMag™磁分离架系列产品(FMS004FMS008FMS012FMS016FMS024)。

分装或使用磁珠时,请适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。

磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象,可以在磁珠聚集后晃动管内液体,使挂壁的磁珠流下。

请使用推荐的样本量。如果样本量过大,可能造成磁珠聚集,会影响洗涤进而影响提取获得的mRNA纯度。发生磁珠聚集时,洗涤时需尽量分散磁珠,这样可有效改善提取效果。如果发生磁珠聚集现象,建议在后续实验中适当减少总样本量。

由于mRNA容易降解,提取获得的mRNA推荐尽快用于RT-PCR等后续实验。如果不能尽快使用,需要-80℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.准备工作。
a.缓冲液的准备。根据实验需要配制相关缓冲液,参考配方如下配制:
Buffers Recipe
Binding Buffer 20mM Tris-HCl (pH7.5), 1M LiCl, 2mM EDTA
Lysis Buffer 100mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM LiCl, 10mM EDTA,1% LiDS, 5mM DTT
Washing Buffer I 10mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM LiCl, 1mM EDTA, 0.1% LiDS
Washing Buffer II 10mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM LiCl, 1mM EDTA
Elution Buffer 10mM Tris-HCl (pH7.5)
注:试剂和耗材的RNase-free要求参见注意事项;试剂在使用时平衡至室温,如有沉淀,可37℃预热10分钟。
b.细胞样品的准备。
(a)贴壁细胞用PBS洗涤一次;悬浮细胞1000-2000×g室温离心5分钟,弃上清,用PBS洗涤一次。
(b)按照细胞量加入推荐的裂解液。通过移液器吹打多次,裂解细胞至溶液变粘稠。
(c)选做:加入溶液裂解液后样品可能会比较粘稠,可适当超声或使用1ml注射器反复抽吸打断基因组DNA从而使粘稠感消失。此操作会产生泡沫,但不影响mRNA的得率。
(d)4℃以14,000×g离心5分钟,并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化,或保存在-80℃备用。
c.动物组织样品的准备。
(a)取所需量的动物组织,置于液氮中研磨成粉末,立即加入推荐量的裂解液。也可将组织置于1.5ml离心管中,迅速加入推荐量的冰浴预冷的裂解液,用微型电动匀浆器匀浆,或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。
(b)4℃以14,000×g离心5分钟,并将上清转移至一个新的离心管。上清可用于mRNA纯化,或保存在-80℃备用。
d.BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠的准备。
(a)将磁珠溶液从4℃冰箱取出,适当涡旋震荡或反复颠倒以确保磁珠充分混匀。参考下表,根据总RNA量和总细胞量或组织重量,取适量的BeyoMag™ Oligo (dT)25磁珠悬液至一洁净离心管中。推荐使用BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, Nuclease free) (FTUB306)
Total RNA Beads required Washing Buffer II
1~10µg 20µl 200µl each time
10~30µg 40µl 200µl each time
30-50µg 100µl 200µl each time

Cell number Tissue mass Lysis Buffer Beads Washing Buffer I Washing Buffer Ⅱ
<5×105 <5mg 100µl 20µl 500µl 500µl each time
1~2×106 5~20mg 300µl 40µl 500µl 500µl each time
3~5×106 20~50mg 600µl 100µl 500µl 500µl each time
(b)无论磁珠用量多少,按照每个样品200µl结合液的量,加入适量结合液洗涤磁珠,用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离30秒,去除上清。重复本步骤1次。说明:如果样品数量超过5个,可以考虑将适量磁珠悬液先直接置于磁力架上分离30秒,去除上清,然后根据样品数量再加入适量结合液洗涤2次。
(c)按照每个样品100µl结合液的量,加入适量溶液结合液重悬磁珠。
2.从细胞或组织样品中分离纯化mRNA。
a.取上述制备好的细胞或组织样品与100µl洗涤后重悬的磁珠在室温下旋转混合5分钟 。
b.置于磁力架上分离1分钟,去除上清。
c.室温下用500µl洗涤液I洗涤磁珠,磁分离30秒,去上清。
d.室温下用500µl洗涤液Ⅱ洗涤磁珠,磁分离30秒,去上清。重复本步骤1次。
e.根据后续实验需求,进行mRNA的洗脱:
(a)从磁珠上洗脱mRNA:加入10-20µl洗脱液或Nuclease-free的水,如DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876),75-80℃孵育2分钟,磁分离30秒,然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中,置于冰上待用。
注:建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解,建议尽快进行后续实验。短时间内不使用,请置于-80℃保存。
(b)如果mRNA不洗脱直接用于后续实验,如固相cDNA文库构建等,用500µl洗涤液Ⅱ洗涤一次,再用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次,即可用于后续实验。
3.从Total RNA中纯化mRNA (以Total RNA的量为20µg为例)。
a.取100µl含有20µg Total RNA的样品与100µl结合液混合。注:如果20µg Total RNA不足100µl,可以用DEPC水或其它适当Nuclease-free溶液补足至100µl。
b.65ºC孵育2分钟以打开RNA的二级结构,孵育结束后迅速置于冰上。
c.将该200µl混合液与100µl洗涤后重悬的磁珠在室温下旋转混合5分钟。
d.置于磁力架上分离1分钟,去除上清。
e.室温下用200µl 洗涤液Ⅱ 洗涤磁珠,磁分离30秒,去上清。重复本步骤1次。
f.根据后续实验需求,进行mRNA的洗脱:
(a)从磁珠上洗脱mRNA:加入10-20µl洗脱液或Nuclease-free的水,如DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876),75-80℃孵育2分钟,磁分离30秒,然后将上清转移到新的Nulcease-free的离心管中,置于冰上待用。
注:建议转移上清时保留少量液体以免吸到磁珠影响后续实验。纯化获得的mRNA极易降解,建议尽快进行后续实验。短时间内不使用,请置于-80℃保存。
(b)如果mRNA不洗脱直接用于后续实验,如固相cDNA文库构建等,用后续实验中相应的缓冲液再洗涤一次,即可用于后续实验。
参考文献:
1.Wommer L, Soerjawinata W, Ulber R, Kampeis P. Eng Life Sci. 2021. 21(10): 558–572.
2.Chaudhary N, Weissman D & Whitehead K A. Nat Rev Drug Discov. 2021.20, 817–838.
3.Wu J, Xiao J, Zhang Z, Wang X, Hu S, Yu J. Genomics Proteom Bioinforma. 2014. 12(2):57-63.
4.Michael R Green, Joseph Sambrook. Cold Spring Harb Protoc. 2019.10:711-714.
5.Nicholas M. Adams, Hali Bordelon, et al. ACS Applied Materials & Interfaces. 2015. 7(11):6062-6069.
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