碧云天生产的RNA/蛋白抽提试剂盒(RNA/Protein Isolation Kit)，也称RNA/蛋白共抽提试剂盒(RNA/Protein Co-isolation Kit)或RNA/蛋白共提取试剂盒(RNA/Protein Co-extraction Kit)，是一种简单、方便、快速地从培养的动物细胞或组织、植物、酵母、细菌或病毒等单个样品中分步分别提取RNA和蛋白质的试剂盒。本试剂盒特别适合用于比较珍贵的样品，可以实现一个样品同时用于RNA和蛋白质的抽提。本试剂盒不仅适用于少量样品的提取，还可用于大量不同样品的同时处理，特别适合同一个样品中RNA和蛋白质后续的同步检测。

本试剂盒操作简单，使用便捷。本试剂盒操作简单快速，仅需约1小时即可完成RNA和蛋白质的提取。本试剂盒基于特殊裂解液多组分分离的原理，分步提取同一个样品的RNA和蛋白质。在样品中加入裂解液后进行裂解或匀浆，使细胞或组织充分裂解，加入氯仿混匀并离心后分为三层，包括上层无色水相(含RNA)，中间相(含DNA和蛋白质)和下层红色有机相(含DNA和蛋白质)。RNA溶于水相中，取出水相后用异丙醇沉淀即可获得纯化的RNA；用无水乙醇沉淀中间相和下层红色有机相的DNA，并进一步用异丙醇沉淀有机相，可获得纯化的蛋白质。这些沉淀通过洗涤去除其它杂质成分后可用于后续的实验[1-2]。

本试剂盒采用高品质抽提试剂。本试剂盒提供的特殊裂解液可以有效抑制RNA的降解，保持样品中RNA的完整性；既可用于小量样品(例如5-100mg组织或20-500万个细胞)，也适用于大量样品(例如大于1g的组织或超过一千万的细胞)。通常，每一百万细胞可抽提得到5-15μg RNA，每毫克组织可抽提得到1-10μg RNA。

本试剂盒抽提所得的RNA和蛋白质纯度高，用途广泛。抽提所得的总RNA无蛋白、DNA污染，溶于DEPC水或不含RNase的超纯水后的A260/280值为1.8-2.0，可直接用于RT-PCR、cDNA克隆、纯化mRNA、Northern blot、Dot blot、体外翻译、以及RNase protection assay等实验，也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序(High-throughput sequencing)等对RNA质量要求较高的实验；提取的蛋白可用于SDS-PAGE、Western blot、免疫沉淀等分析。

本试剂盒小包装和中包装分别可以抽提25个或100个6孔板中的细胞样品或10-80mg的组织样品。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
R0018S-1	裂解液	25ml
R0018S-2	洗涤液I	22ml (第一次使用前需加入44ml无水乙醇)
R0018S-3	洗涤液II	7.5ml (第一次使用前需加入112.5ml无水乙醇)
R0018S-4	蛋白溶解液	5ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
R0018M-1	裂解液	100ml
R0018M-2	洗涤液I	88ml (第一次使用前需加入176ml无水乙醇)
R0018M-3	洗涤液II	30ml (第一次使用前需加入450ml无水乙醇)
R0018M-4	蛋白溶解液	20ml
—	说明书	1份

保存条件：

4ºC保存，一年有效。

注意事项：

用户需自备无水异丙醇、氯仿、无水乙醇、DEPC水(R0021/ST036)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。

所有离心管，枪头及相关溶液都必须无RNA酶污染。耐高温器物可150℃烘烤4小时以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。

使用冻存的细胞或组织抽提总RNA的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的RNase会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽提RNA，推荐先加入适量裂解液，并裂解样品后冻存。

必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。建议戴一次性口罩操作。

裂解液含有毒物质，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触裂解液，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.准备工作：
洗涤液I、洗涤液II第一次使用前需分别加入相应的无水乙醇。
2.样品的裂解：
a.细胞裂解或组织匀浆。
(a)贴壁细胞。
吸尽培养液，每10cm2细胞加入1ml裂解液。一般6孔板每孔加1ml裂解液，12孔板每孔加0.5ml裂解液。晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。
(b)悬浮细胞。
离心收集细胞，吸尽液体，每500-1000万动植物或酵母细胞，或1000万细菌，加入1ml裂解液。用枪吹打或适当Vortex，确保全部裂解。注：某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，以确保全部裂解。
(c)组织。
先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50-80mg组织加入1ml裂解液，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入裂解液进行总RNA抽提。
b.对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，裂解液裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12,000×g在4℃离心10分钟，然后吸取澄清的裂解液裂解产物至一新的离心管中。
c.室温孵育5分钟，使样品充分裂解。
d.按每毫升裂解液加入0.2ml氯仿，Vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温孵育2-3分钟。
e.12,000×g在4℃离心15分钟。此时可见分层，分别为无色水相(上层)，中间层和红色有机相(下层)。其中上层无色水相用于RNA的提取(步骤3)，中间层和下层红色有机相用于蛋白质的提取(步骤4)。
3.RNA的提取：
a.吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升最初的裂解液约可吸取0.5-0.55ml。注：不要吸到中间层和红色有机相(下层)。如果要分离蛋白质可保留这两部分，4℃可存放过夜。
b.按每毫升最初的裂解液加入0.5ml无水异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。如果希望提取microRNA等小RNA，推荐-80℃沉淀过夜。
c.12,000×g在4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
d.每毫升最初的裂解液加入1ml洗涤液I，Vortex或颠倒混匀。
e.7,500×g在4℃离心5分钟，弃上清。再用离心机瞬时离心(>5,000×g)，小心吸尽液体。
f.待RNA略干后，加入20-50μl DEPC水(R0021/R0022)或BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)溶解，-80℃冻存。注：切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。
4.蛋白的提取：
a.接RNA提取步骤3a，尽可能去除上层的水相后，保留中间相和红色有机相(下层)。
b.按每毫升最初的裂解液加入0.3ml无水乙醇，颠倒数次混匀。室温孵育2-3分钟。
c.2,000×g在4℃离心5分钟，吸取上清至一新的离心管中。
d.按每毫升最初的裂解液加入1.5ml无水异丙醇的量，在上清中加入适量无水异丙醇，室温孵育10分钟。
e.12,000×g在4℃离心10分钟，弃上清。
f.用洗涤液II洗涤蛋白质沉淀。每毫升最初的裂解液加入1ml洗涤液II，室温孵育20分钟。蛋白质在洗涤液II中，4℃可保存一个月，-20℃可保存一年。
g.7500×g在4℃离心5分钟，弃上清。
h.重复步骤4f-g 2-3次。
i.按每毫升最初的裂解液加入1.5-2ml无水乙醇，Vortex混匀。室温孵育20分钟。
j.7500×g在4℃离心5分钟，弃上清。
k.室温放置晾干蛋白质沉淀5-10分钟，用200μl蛋白溶解液溶解蛋白质，反复吸打，可用50℃温浴使其完全溶解。
l.10,000×g在4℃离心10分钟去除不溶物。
m.分离得到的蛋白质样品可用于下游实验或-20℃保存备用。
常见问题：

Problem		Possible Causes
RNA	产量低	样品未完全裂解。
		提取的RNA沉淀没有完全溶解。
	A260/A280 Ratio <1.65	样品量过少。
		无色水相(上层)可能被中间层污染。
	降解	提取的RNA沉淀没有完全溶解。
		获取组织后，未立即处理或进行冷冻。
		细胞可能被胰蛋白酶过度消化。
		耗材或操作环境中可能含RNase。
	DNA污染	用于样品均质化的裂解液过少。
		样品可能含有有机溶剂(乙醇、DMSO)、强缓冲液或碱性溶液。
蛋白	产量低	样品未完全裂解。
		提取的蛋白沉淀没有完全溶解。
	降解	获取组织后，未立即处理或进行冷冻。
	PAGE条带变形	蛋白质沉淀未充分洗涤。

参考文献：
1.Jiang J, Ma J, Liu B, Wang Y. Viruses. 2019. 11(4):324.
2.Thorn CE, Bergesch C, Joyce A, Sambrano G, et al. Mol Ecol Resour. 2019. 19(2):439-455.
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