碧云天的Human MIF ELISA Kit (Human Macrophage Migration Inhibitory Factor Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay Kit)，即人巨噬细胞移动抑制因子酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的MIF的ELISA试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。多次重复检测结果表明，最小检出量为18pg/ml，与人的IL-1、IL-6、IL-8、ICAM、SDF-1α、SDF-1βI及小鼠MIF等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF or MMIF)作为最初被发现的细胞因子之一，起初被认为能够随意抑制巨噬细胞的迁移，之后被证实对巨噬细胞具有趋化作用。进一步研究发现MIF并非细胞因子受体的典型配体，因此MIF现在被认为仅仅是一种具有细胞因子功能的蛋白质，又称为micro chemokines。MIF是一种重要的固有免疫应答调节因子，在炎症、自身免疫性疾病和癌症等病理过程中具有重要作用。人MIF基因编码产生分子量为12.5kDa，115个氨基酸的分泌型MIF蛋白，MIF通常以同源二聚体的形式存在，但也有以单体或二聚体存在的可能。MIF具有一定的互变异构酶和氧化还原酶活性，但MIF作为蛋白酶所具有的生物学意义目前尚未确定。
免疫系统中多种细胞都能表达MIF。例如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和动脉粥样硬化泡沫细胞。同时在内皮细胞、平滑肌细胞及动脉粥样硬化、肿瘤新生血管和内分泌组织等非免疫性组织中也有表达。部分MIF的活化需要CD74的参与，同时以CD44作为辅助受体。其它MIF与CXCR4或CXCR7等细胞因子受体结合，发挥细胞因子样功能。另外MIF还能与细胞内的Jab1结合，减轻Jab1介导的G1期细胞周期阻滞。
MIF调节急性或慢性炎症反应，当受到内毒素或促炎性细胞因子刺激时，MIF就会被分泌出来。MIF对细胞的生成和存活具有旁分泌和自分泌的刺激效应，还能够促进炎性细胞因子的产生，并且还能抑制免疫抑制性糖皮质激素发挥功能。敲除MIF基因会抑制模型小鼠发生内毒素血症和感染性休克。在人体内，当出现败血症或感染性休克及急性呼吸窘迫综合征时，血液中MIF水平会有所上升。另外，MIF表达的升高还与血管密度升高及肿瘤复发风险相关。MIF被认为能够增加慢性炎症病人的患癌风险。
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法(Sandwich ELISA)检测样品中人MIF的浓度，其原理见图1。人MIF特异的单克隆捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标准品或样品时，其中的人MIF会与捕获抗体结合。当加入生物素化的抗人MIF抗体后，生物素化抗人MIF抗体与人MIF结合，形成夹心的免疫复合物。随后加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素与链霉亲和素(Streptavidin)可以特异性地结合，因此链霉亲和素连接的HRP就会与夹心的免疫复合物连接起来而被固相捕获。最后加入显色剂TMB溶液，固相捕获的辣根过氧化物酶就会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。人MIF浓度与A450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中人MIF浓度。
图1. 双抗体夹心ELISA原理图。
一个包装的本试剂盒，包括标准品检测，可以进行96次检测。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| PM715-1 | 人MIF抗体预包被板 | 8孔×12条 |
| PM715-2 | 样品分析缓冲液 | 5ml |
| PM715-3 | 标准品稀释液(5X) | 10ml |
| PM715-4 | 人MIF标准品 | 2-4瓶 |
| PM715-5 | 人MIF生物素化抗体 | 10ml |
| PM715-6 | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 10ml |
| PM715-7 | 洗涤液(20X) | 30ml |
| PM715-8 | TMB溶液 | 10ml |
| PM715-9 | 终止液 | 5ml |
| PM715-10 | 封板膜(透明) | 2张 |
| PM715-11 | 封板膜(白色) | 2张 |
| - | 说明书 | 1份 |
使用说明：
1.样品准备
a. 样品的准备请按下列流程进行操作：
(a)细胞上清样品离心取上清即可(如100-500g，5分钟)。
(b)对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。
(c)对于血浆样品，采集的全血建议使用EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。
(d)若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。
b.血清样品不应添加任何防腐剂或抗凝剂。
c.样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。
d.请勿使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
注：血清或血浆样品可能需要用1X标准品稀释液倍比稀释后再检测。
2.检测前准备工作
a.试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
b.配制适当量的标准品稀释液：将标准品稀释液(5X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml标准品稀释液(5X)加40ml水混匀后即为1X的标准品稀释液。
c.配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。
d.按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液(如提供新生牛血清，请使用新生牛血清对标准品进行溶解)至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到2000pg/ml。通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要使用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。
e.取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液(如提供新生牛血清，请使用新生牛血清对标准品进行稀释)，并参考图2进行标准品的倍比稀释，最终得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共七个标准品浓度。
图2. 标准品倍比稀释示意图。按标准品(STANDARD)标签上标注体积加入标准品稀释液(如提供新生牛血清，请使用新生牛血清)溶解并混匀后的浓度为标准品的起始浓度。其它的倍比稀释后的浓度依次为起始浓度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。
3.洗涤方法
自动洗板机或手工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。
4.实验过程需自备的材料和仪器
a.不同规格的移液枪及相应的吸头
b.酶标仪
c.自动洗板机(如果没有也可以手工洗板)
d.去离子水或双蒸水
5.操作步骤
a.计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。
b.每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。
c.分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆样品的MIF的检测，不同样品稀释比例有所区别，一般范围在5-20倍，如无明确范围，建议从10倍开始稀释，加样时可以先加入样品分析缓冲液50μl/孔，随后再加入50μl用1X标准品稀释液稀释后的样品。如果样品浓度过高，超过检测范围，请加大稀释倍数后重新稀释检测。请注意记录好样品的稀释倍数。
注意：请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请适当稀释或浓缩后再进行检测。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
e.加入生物素化抗体100μl/孔(注：此生物素化抗体已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60分钟。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
g.加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根过氧化物酶标记Streptavidin已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
i.加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育15-20分钟。室温偏低时需要适当延长孵育时间，此时可以孵育至标准品出现非常显著的颜色变化，若样本浓度足够高也会出现显著的颜色变化。
j.加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。
6.结果分析
a.复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
b.每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。
c.绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
图3. Human MIF ELISA Kit的标准曲线。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
d.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。
相关产品：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| PM715 | Human MIF ELISA Kit | 96次 |
