碧云天生产的Human Amyloid β-Peptide(1-42)ELISA Kit (Human Amyloid β-Peptide(1-42)Enzyme-Linked ImmunoSorbent AssayKit)，即人β-淀粉样蛋白肽(1-42)酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人脑脊液中的Amyloid β-Peptide(1-42)的ELISA试剂盒。

本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。多次重复检测结果表明，最小检出量为109pg/ml，与人Amyloid Protein及大、小鼠Amyloid β-Peptide (1-40)等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。

淀粉样β肽(Amyloid β-Peptide, Aβ)是淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的蛋白水解片段，其形成的原纤维在阿尔茨海默病病理过程中起着不可或缺的作用。阿尔兹海默病患者的一个主要特征就是大脑中高毒性物质的积累，即衰老斑块或老年斑(Senile plaques, SP)的积累。Aβ原纤维构成SP的主要蛋白质成分，在缺氧、创伤性脑损伤和慢性炎症的情况下，SP积聚增加。Aβ也直接对神经元产生多重作用。APP是一种多功能跨膜蛋白，由682个氨基酸胞外结构域(Extracellular domain, ECD)、24个氨基酸跨膜段和47个氨基酸胞质结构域组成，其ECD包含两个肝素结合域、一个铜结合域、一个BPTI/Kunitz结构域和一个胶原结合域。

APP在多个位点发生蛋白水解裂解，可能导致也可能不导致Aβ的产生。在非淀粉样变性途径(Non-amyloidogenic pathway)中，经Aβ区域内的α-分泌酶(α-secretase)切割，抑制Aβ生成，并释放可溶性APP-α和C端片段α (C-terminalfragment α, CTF-α) 。CTF-α再经过γ-分泌酶(γ-secretase)切割，生成无毒性的P3肽和APP胞内结构域(APP intracellular domain, AICD)，释放到细胞质的AICD片段被蛋白酶降解。淀粉样途径(Amyloidogenic pathway)即病理过程是指APP在质膜上被β-分泌酶(β-secretase，又称β-site amyloid cleavage enzyme,BACE)和γ-分泌酶在N端和C端的顺序切割，生成可溶性APPβ和C端片段β (C-terminalfragment β, CTF-β)。CTF-β再经过γ-分泌酶切割，生成不同长度的Aβ片段和AICD。被β-分泌酶和γ-分泌酶水解断裂产生的Aβ为含有38-43个氨基酸的肽链，其中Aβ (1-40)和Aβ (1-42)含量最多。Aβ(1-40)在脑脊液中相对丰富，而Aβ (1-42)更疏水，更容易聚集，与阿尔茨海默病的病理学关系更密切，这种肽的异常高水平形成并在阿尔茨海默病患者的大脑中积累，形成该病特有的SP。人Aβ(1-42)与小鼠和大鼠Aβ (1-42)具有约93%的氨基酸同源性。

Aβ肽可在细胞内结合成二聚体、高阶低聚物和不溶性纤维。它们增强了Tau蛋白的过度磷酸化(Hyperphosphorylation)和神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles)的形成。Aβ还与ApoE形成纤维并与朊蛋白PrPC结合。在各种形式的Aβ中，低聚物在损害认知功能、抑制海马神经元长时程增强(Long term potentiation, LTP)和诱导神经元氧化应激(Oxidative stress)方面最为有效。相反，单体Aβ可以防止兴奋毒性神经元细胞死亡。Aβ可直接破坏神经元膜的完整性，其神经毒性通过其体内糖基化或焦谷氨酰胺基化(Pyroglutamylation)而增加。Aβ与晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products, RAGE)的相互作用导致神经元线粒体功能障碍、氧化应激、星形胶质细胞和小胶质细胞的炎症激活，以及循环Aβ穿过血脑屏障进入大脑。Aβ还通过与TLR2的相互作用诱导神经炎症。

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法(Sandwich ELISA)检测 样品中人Amyloid β-Peptide(1-42)的浓度，其原理见图1。人Amyloid β-Peptide(1-42)特异的单克隆捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标准品或样品时，其中的人Amyloid β-Peptide(1-42)会与捕获抗体结合。当加入生物素化的抗人Amyloid β-Peptide(1-42)抗体后，生物素化抗人Amyloid β-Peptide(1-42)抗体与人Amyloid β-Peptide(1-42)结合，形成夹心的免疫复合物。随后加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素与链霉亲和素(Streptavidin)可以特异性地结合，因此链霉亲和素连接的HRP就会与夹心的免疫复合物连接起来而被固相捕获。最后加入显色剂TMB溶液，固相捕获的辣根过氧化物酶就会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。人Amyloid β-Peptide(1-42)浓度与A450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中靶蛋白浓度。

图1. 双抗体夹心ELISA原理图。

一个包装的本试剂盒，包括标准品检测，可以进行96次检测。

包装清单： 保存条件：

标准品4℃保存，1-2周内有效，-20℃保存6个月内有效，试剂盒其它组分4℃保存6个月内有效。除标准品外，试剂盒其它组分严禁冻存。

注意事项：

由于标准品一般是冻干粉，在制备后需要严格校准，所以标准品的瓶数及每瓶标准品所需加入的稀释液体积请以实际收到的试剂盒及标准品标签上的标注为准。

洗涤液(20X)在低温下可能有结晶，如果发现有结晶，请室温水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

为保证标准品的精确性，标准品配制使用后，如果有剩余请勿再次使用。

TMB溶液请勿接触氧化剂和金属，否则容易失效。

加样时，请注意每个样品或标准品必须更换枪头，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取体积的误差。

由于本试剂盒均经过独立测试，所以请勿混用不同货号和不同批次的试剂盒组分，即使是同种试剂盒不同批次的试剂盒组分也不能混用。多个试剂盒同时检测时，请独立使用各个试剂盒中的试剂，请勿使用不同试剂盒中相同名称的组分。

充分混匀对保证反应结果的精准性很重要，在加液后请轻轻晃动整个96孔板，以保证混匀。

本试剂盒很多操作在室温进行，要求严格控制室温在25-28℃。温度低于25℃会导致最终检测到的吸光度显著下降。

洗涤过程非常重要，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

检测标准品和样品时建议设置重复孔，以确保检测结果的可信度。

加样过程中须避免气泡的产生。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.样品准备
a. 样品的准备请按下列流程进行操作：
(a) 细胞上清样品离心取上清即可(如100-500×g，5分钟)。
(b) 对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。
(c) 对于血浆样品，采集的全血建议使用EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。
(d) 若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。
b. 血清样品不应添加任何防腐剂或抗凝剂。
c. 样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。
d. 请勿使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
注：人血清或血浆样品可能因含量过低而检测不出。
2. 检测前准备工作
a. 试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)
平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
b. 配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。
c. 按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到4000pg/ml 。通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要使用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。
d. 取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先加入250μl的标准品稀释液，并参考图2进行标准品的倍比稀释，最终得到4000、2000、1000、500、250、125pg/ml共六个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml 浓度，共七个标准品浓度。 图2. 标准品倍比稀释示意图。按标准品(STANDARD)标签上标注体积加入标准品稀释液溶解并混匀后的浓度为标准品的起始浓度。其它的倍比稀释后的浓度依次为起始浓度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。
3. 洗涤方法
自动洗板机或手工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。
4. 实验过程需自备的材料和仪器
a. 不同规格的移液枪及相应的吸头
b. 酶标仪
c. 自动洗板机(如果没有也可以手工洗板)
d. 去离子水或双蒸水
5. 操作步骤
a. 计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。
b. 每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。
c. 分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。对于细胞上清样本和血清血浆样本，可能因含量低而检测不出。脑脊液样本直接加样100μl，如果样品浓度过高超出检测范围，请先稀释后再检测。
注：请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请适当稀释或浓缩后再进行检测。
d. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
e. 加入生物素化抗体100μl/孔(注：此生物素化抗体已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60分钟 。
f. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
g. 加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根过氧化物酶标记Streptavidin已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。
h. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
i. 加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育15-20分钟。室温偏低时需要适当延长孵育时间，此时可以孵育至标准品和样品出现非常显著的颜色变化。
j. 加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。
6. 结果分析
a. 复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
b. 每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。
c. 绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
图3.Human Amyloid β-Peptide(1-42)ELISA Kit的标准曲线。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
d. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。
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