碧云天生产的Active Ras Pull-down and Detection Kit，也称活性Ras沉淀与检测试剂盒，是一种便捷、高效的用于定量检测组织或细胞裂解液中激活状态(Active state) Ras蛋白(包括NRas、HRas和KRas)的试剂盒。本试剂盒基于Raf1-RBD Agarose (活性Ras结合琼脂糖凝胶)特异性地结合沉淀(Pull-down)激活状态的Ras蛋白，通过Western检测Ras蛋白的激活水平(图1)。

图1. 碧云天Active Ras Pull-down and Detection Kit (P2433)的Pull-down工作原理图。洗脱产物后续可以用于Western检测。

Raf1是与Ras蛋白(包括NRas、HRas和KRas)相互作用的一种下游效应蛋白(Effector protein)，在细胞增殖、分化、凋亡、存活和致癌转化中起重要作用。Raf1全长648个氨基酸，理论分子量为73kDa，含有4个结构域：激活状态Ras的结合结构域(Active Ras-binding domain, RBD)、半胱氨酸富含区结构域(Cysteine-rich domain, CRD)、参与Raf1激活的抑制性磷酸化位点和激酶结构域。Raf1的RBD结构域可以特异性的识别并结合激活状态的Ras蛋白，但不结合静息状态的Ras蛋白，因此Raf1-RBD重组蛋白可用于检测激活状态的Ras蛋白，在体内或体外也可以作为Ras蛋白的抑制剂使用[1]。

小GTP酶(Small GTPase)，也称Small G-proteins、Ras superfamily，是调节真核细胞信号转导、细胞增殖、细胞骨架重组和细胞内膜转运等过程的分子开关，小GTP酶通过结合和水解GTP，在“激活”和“静息”状态之间循环：在外界信号的刺激下，鸟苷酸交换因子(Guanine nucleotide-exchange factors, GEFs)辅助小GTP酶将结合的GDP置换为GTP，小GTP酶结合GTP进入激活状态(Active state)；激活状态的小GTP酶与下游效应蛋白(Effector protein)相互作用，从而刺激细胞发生相应的响应；GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)催化小GTP酶结合的GTP水解为GDP，并释放自由磷酸盐(Free phosphate, Pi)，此时小GTP酶结合GDP进入静息状态(Inactive state)，鸟嘌呤核苷酸解离抑制蛋白(Guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs)抑制小GTP酶释放GDP，直到GEFs受到刺激信号再次开启新一轮的循环(图2) [2-3]。

图2. 小GTP酶在“激活”和“静息”状态之间循环的原理图。

小GTP酶在人类中已发现超过150个家族成员，在果蝇(Drosophila)、秀丽隐杆线虫(C. elegans)、酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、黏菌(Dictyostelium)和植物中也都发现了保守的同源物。小GTP酶根据结构和功能被分为5个家族分支：Ras家族、Rho家族、Ran家族、Rab家族和Arf家族。Ras家族本身又被分为6个亚家族：Ras亚家族、Ral亚家族、Rit亚家族、Rap亚家族、Rheb亚家族和Rad亚家族[4]。

Ras家族(Ras homologous GTPases)是调节肌动蛋白重组的关键因子，因此在肌动蛋白细胞骨架完整性、细胞增殖、细胞分化、细胞粘附、细胞凋亡和细胞迁移等细胞过程中发挥着重要作用。目前有16个成员被发现，被分为6个亚家族(见下表)，其中NRas、HRas和KRas研究的最为广泛[5]。

Subfamily	Ras	Ral	Rit	Rap	Rheb	Rad
Subfamily members	HRas NRas KRas4A KRas4B	RalA RalB	Rit1 Rit2	Rap1A Rap1B Rap2A Rap2B Rap2C	Rheb RhebL1	RRad

本试剂盒检测NIH 3T3细胞内源性激活状态Ras蛋白的效果见图3。实验采用GppNHp (鸟苷酰亚胺二磷酸锂)作为GTP替代物，GppNHp与GTPγS类似，都是一种不可水解的GTP类似物[6]。

图3. 碧云天Active Ras Pull-down and Detection Kit (P2433)用于检测NIH 3T3细胞内源性激活状态Ras蛋白的效果图。NIH3T3细胞裂解液分别加入终浓度为1mM GppNHp或GDP使Ras蛋白处于激活状态(Active state)或静息状态(Inactive state)，随后加入50μl Raf1-RBD Agarose，置于旋转混合仪上，4ºC孵育2小时。后经离心、洗涤，再加入1X SDS-PAGE上样缓冲液95ºC加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳后进行Western检测，使用Ras Rabbit Monoclonal Antibody孵育。Western印迹成像使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统完成(EI600)。Control为2ng Recombinant Human NRas (泳道1)，Input为NIH 3T3细胞裂解液(泳道2)。本试剂盒可特异性地结合并Pull-down激活状态的Ras蛋白(Ras-GppNHp) (泳道3)，但不结合静息状态的Ras蛋白(Ras-GDP) (泳道4)。“-”为NIH 3T3细胞天然存在激活状态的Ras蛋白(泳道5)。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

Raf1-RBD Agarose储存溶液: 50mM HEPES (pH7.4), 150mM NaCl, 5mM MgCl₂, 0.5% Triton X-100, 1mM DTT, 10% glycerol.

按照单次使用20μl Raf1-RBD Agarose计算，本产品的小包装和中包装分别用于50次和250次实验。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P2433S-1	Raf1-RBD Agarose	1ml
P2433S-2	Recombinant Human NRas (10ng/μl)	100μl
P2433S-3	Ras Rabbit Monoclonal Antibody (1000X)	20μl
P2433S-4	GppNHp (100X)	20μl
P2433S-5	GDP (100X)	20μl
P2433S-6	Cell Lysis Buffer	50ml
P2433S-7	Wash Buffer	50ml
P2433S-8	100mM EDTA (pH8.0)	200μl
P2433S-9	60mM MgCl2	200μl
P2433S-10	Protease Inhibitor Cocktail (100X)	400μl
－	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
P2433M-1	Raf1-RBD Agarose	5ml
P2433M-2	Recombinant Human NRas (10ng/μl)	500μl
P2433M-3	Ras Rabbit Monoclonal Antibody (1000X)	100μl
P2433M-4	GppNHp (100X)	100μl
P2433M-5	GDP (100X)	100μl
P2433M-6	Cell Lysis Buffer	250ml
P2433M-7	Wash Buffer	250ml
P2433M-8	100mM EDTA (pH8.0)	1ml
P2433M-9	60mM MgCl2	1ml
P2433M-10	Protease Inhibitor Cocktail (100X)	1ml×2
－	说明书	1份

保存条件：

-80ºC保存，一年有效。除Raf1-RBD Agarose外，-20ºC保存，一年有效。

注意事项：

Raf1-RBD Agarose到货后推荐-80ºC冻存，冻融两次有效，避免反复冻融，第一次使用可适当分装。其余试剂可以-20ºC冻存。

本试剂盒的使用次数按照单次使用20μl或50μl Raf1-RBD Agarose来设置。当使用不同量Raf1-RBD Agarose时，其它试剂用量也可相应按比例进行调整。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 试剂盒的准备。
a. 含抑制剂裂解液的配制。按照每50-100万细胞使用100-200μl含抑制剂裂解液，配制适量的含抑制剂裂解液。将Cell Lysis Buffer与Protease Inhibitor Cocktail (100X)按照100:1的比例混合，例如在1ml的Lysis Buffer中加入10μl Protease Inhibitor Cocktail (100X)，即得1ml含抑制剂裂解液(Cell Lysis Buffer with Protease Inhibitor Cocktail)。配制好的含抑制剂裂解液置冰浴或4ºC。
注：含抑制剂裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存并留作后续使用。如果有特殊需求，可以尝试碧云天的其它多种蛋白酶、磷酸酶和去乙酰化酶抑制剂混合物：https://www.beyotime.com/support/lysis-inhibitor cocktail.htm。
b. 1X TBS的配制。由于镁离子参与Ras蛋白与GTP和GDP的结合，使用含有磷酸根的缓冲液(如PBS)会生成难溶于水的磷酸镁影响后续Pull-down实验。推荐使用碧云天TBS (10X) (ST661)，免除磷酸根的干扰。用超纯水将TBS稀释至1X备用，例如取1ml TBS (10X)加入9ml超纯水，混匀后即为1X TBS。
c. Raf1-RBD Agarose的准备。由于Raf1-RBD Agarose储存在保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
(a) 轻轻重悬Raf1-RBD Agarose，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，按照通常每200μl细胞或组织裂解液中加入20μl混合均匀的凝胶悬浊液，取适量Raf1-RBD Agarose至一洁净离心管中，按照每20μl凝胶悬浊液加入约100-180μl Cell Lysis Buffer的比例，加入Cell Lysis Buffer进行洗涤。
注：建议使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液，减少机械剪切力对凝胶的损伤。
(b) 轻轻重悬Raf1-RBD Agarose，6000×g在4ºC离心30秒，小心去除上清，不要吸到凝胶。重复上述步骤三次。
(c) 按照初始的凝胶悬浊液的体积，用Cell Lysis Buffer重悬Raf1-RBD Agarose。
d. SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)的配制。推荐直接使用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X) (P0015A)，或将适量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015/P0015B/P0015F/P0015L)用超纯水稀释至1X后再使用。
2. 细胞或组织样品的裂解和准备。
注1：样品裂解后宜立即进行Pull-down，如果不能立即进行后续的实验，样品应尽快分装，用液氮速冻后-80ºC冻存，请勿反复冻融。
注2：裂解和Pull-down实验过程中需时刻保证样品在冰浴或4ºC操作，以尽量减少蛋白降解的可能性。
注3：样品准备好后，取一定量作为Input，用于后续的Western检测。
注4：裂解后会出现少量不溶性物质，主要为基因组DNA等，离心后会产生沉淀物。
注5：如有待测的激活剂或抑制剂可提前对样品进行处理。
a. 悬浮细胞的样品裂解和准备。250×g室温离心5分钟收集细胞，用4ºC预冷的1X TBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。轻轻vortex或者弹击管底把细胞尽量分散开。按照每50-100万细胞的比例加入100-200μl 4ºC预冷的含抑制剂裂解液。轻弹管底或适当吹打，使裂解液与细胞充分接触，以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，建议分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液易与细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。充分裂解后，14,000×g在4ºC离心5分钟，取上清，即可进行后续的Pull-down实验。
b. 贴壁细胞样品的裂解和准备。吸除培养液。用4ºC预冷的1X TBS洗涤一次，然后吸净残留的液体。按照每50-100万细胞(相当于6孔板的一个孔)加入100-200μl 4ºC预冷的含抑制剂裂解液，适当吹打，使裂解液与细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。充分裂解后，14,000×g在4ºC离心5分钟，取上清，即可进行后续的Pull-down实验。注：1X TBS的残留可能会影响后续实验，因此建议在吸净1X TBS后，将细胞培养皿在冰上以一定角度倾斜静置1分钟后，以彻底吸净残留的液体。
c. 组织样品的裂解和准备。
(a) 把组织剪切成细小的碎片。如果组织样品本身非常细小，也可以不再进行剪切。
(b) 按照每10-20mg组织加入100-200μl 4ºC预冷的含抑制剂裂解液。注：如果裂解不充分可以使用更多4ºC预冷的含抑制剂裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
(c) 用玻璃匀浆器匀浆，或使用碧云天生产的TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)研磨，直至充分裂解。也可以把组织样品冷冻后液氮研磨，研磨充分后加入4ºC预冷的含抑制剂裂解液进行裂解。
(d) 充分裂解后，14,000×g在4ºC离心5分钟，取上清，即可进行后续的Pull-down实验。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200μl含抑制剂裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同。
3. 对照组的设置。
本实验一般设置Control组、Input组、GppNHp处理组(阳性对照组)、GDP处理组(阴性对照组)，如有待测的激活剂或抑制剂可设为样品处理组。
a. Recombinant Human NRas组 (Control组)。
本试剂盒提供Recombinant Human NRas (10ng/μl)作为Western检测的阳性对照，也可以作为衡量内源性Ras蛋白表达量的参照。通常1-10ng Recombinant Human NRas (10ng/μl)足够在Western检测中能得到较好信号。注：Ras蛋白(包括NRas、HRas和KRas)理论分子量约为20-25kDa，Recombinant Human NRas因带有Flag标签比内源性NRas蛋白分子量偏大(约22kDa)。
b. 细胞或组织裂解液GppNHp/GDP处理组(阳性/阴性对照组)。
为准确检测细胞或组织裂解液中激活状态的Ras蛋白，保证Pull-down实验的正确操作，建议每次实验额外准备2组样品，分别加入GppNHp和GDP使裂解液中全部Ras蛋白分别处于激活状态(阳性对照)和静息状态(阴性对照)。
(a) 向200μl的细胞或组织裂解液样品中加入20μl 100mM EDTA (pH8.0)，螯合细胞或组织裂解液样品中的Mg2+，使裂解液中的Ras蛋白释放其本身结合的GTP或GDP，轻轻吹打混匀。
(b) 根据阳性对照和阴性对照的设置，加入2μl GppNHp (100X)或GDP (100X)，轻轻吹打混匀，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育15-30分钟。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
注：小包装和中包装中的GppNHp (100X)和GDP (100X)各提供5次和25次。
(c) 加入20μl 60mM MgCl2将GppNHp或GDP锁定在Ras蛋白上。
(d) 后续操作同实验组，即步骤4。
4. Pull-down激活状态Ras蛋白。
a. 向200μl的细胞或组织裂解液样品中加入20μl经Cell Lysis Buffer洗涤过的Raf1-RBD Agarose，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，4ºC孵育1-3小时。
注：Raf1-RBD Agarose的投入量可进行调整，一般单次实验的投入量为20-50μl。相同的样品，不同投入量的Raf1-RBD Agarose可能导致不同的结果。如果Raf1-RBD Agarose投入量过低，可能无法有效Pull-down激活状态的Ras蛋白；如果Raf1-RBD Agarose投入量过高，可能导致Raf1-RBD Agarose非特异性结合静息状态的Ras蛋白，导致假阳性的出现；通常20-50μl Raf1-RBD Agarose能得到较好的效果，但是仍需要根据实际情况调整Raf1-RBD Agarose的用量。但为了方便起见，更建议固定Raf1-RBD Agarose的用量不变，而适当调整样品裂解液的用量或浓度。裂解液中激活状态Ras蛋白过多时，可能会使Raf1-RBD Agarose饱和，从而超出检测范围。如果样品的信号低于添加了GppNHp的阳性对照的信号，说明Raf1-RBD Agarose并未饱和，检测结果仍然在可信范围内。
b. 6000×g在4ºC离心30秒，小心去除上清，注意不要吸到凝胶。
c. 加入500μl 4ºC预冷的Wash Buffer，上下颠倒重悬凝胶，6000×g在4ºC离心30秒，小心去除上清，注意不要吸到凝胶。重复本步骤三次。
d. 加入50μl SDS-PAGE Sample Loading Buffer (1X)，95ºC加热5分钟。样品可直接上样SDS-PAGE胶进行电泳，如果不能立即进行后续的实验，可以-20ºC冻存。
5. Western检测。
a. 蛋白样品平衡到室温后，取10-30μl Pull-down后的各组样品(Control组、Input组、阳性对照组、阴性对照组、样品处理组)上样至SDS-PAGE凝胶(P0468)进行电泳，随后进行转膜。
注1：推荐选用PVDF膜(FFP24/FFP26/FFP28/FFP32/FFP33/FFP36/FFP39)，其中最优先推荐使用PVDF膜(进口分装，6.6×8.5cm, 0.2μm) (FFP24/FFP26)。PVDF膜在使用前须经浸润和活化，推荐使用碧云天生产的安全无毒的PVDF膜浸润活化液(P0021S)。也可以使用硝酸纤维素膜(NC膜) (FFN02/FFN03/FFN05/FFN060/FFN61/FFN063/FFN08)，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先加入Western洗涤液(P0023C/P0023C3/P0023C6)的Western洗膜盒(FFX050/FFX052/FFX055)中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
注2：转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
b. 用微型台式真空泵(E0110/E0111/E0112/E0113/E0114/E0115)或滴管等吸尽洗涤液，优先推荐加入适量的QuickBlock™ Western封闭液(P0252)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭10分钟；也可以加入Western封闭液(P0023B)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
c. 吸尽封闭液，立即加入按照1:1000比例用QuickBlock™ Western一抗稀释液(P0256)或Western一抗稀释液(P0023A)稀释的Ras Rabbit Monoclonal Antibody，4ºC在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜。
d. 回收一抗。加入Western洗涤液 ，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，重复洗涤3次。
注：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
e. 按照适当比例用QuickBlock™ Western二抗稀释液(P0258)或Western二抗稀释液(P0023D)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，推荐使用辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208)。室温或4ºC在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
f. 回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，重复洗涤3次。
注：如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
g. 使用BeyoECL Star (P0018A)或BeyoECL Moon (P0018F)等ECL类试剂来检测蛋白。
注：Ras蛋白(包括NRas、HRas和KRas)理论分子量为20-25kDa。
参考文献：
1. Tran TH, Chan AH, Young LC, Bindu L, Neale C. Nat Commun. 2021. 12(1):1176.
2. Vernoud V, Horton AC, Yang Z, Nielsen E. Plant Physiol. 2003. 131(3):1191-208.
3. Ito H, Morishita R, Nagata KI. Int J Mol Sci. 2018. 19(7):2121.
4. Goitre L, Trapani E, Trabalzini L, Retta SF. Methods Mol Biol. 2014. 1120:1-18.
5. Bos JL. Cancer Res. 1989. 49(17): 4682–9.
6. Mann D, Güldenhaupt J, Schartner J, Gerwert K, Kötting C. J Biol Chem. 2018. 293(11):3871-9.
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P2413-1mg	Recombinant Human KRas4B (G12V, His-Tag)	1mg
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