重组SENP2蛋白酶(His-tag)
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产品编号 P2313-2KU
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¥ 899.00
产品包装:
500U 2KU 10KU 50KU
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碧云天生产的重组SENP2蛋白酶(His-tag),即Recombinant SENP2 (His-tag)或rSENP2 (His-tag),是一种通过 E.coli重组表达的包含人源SENP2的酶活结构域(Asp364-Leu589)和His标签的蛋白酶,理论分子量为26.8kDa,常用于体外去SUMO化修饰(DeSUMOylation)反应,或切除融合表达的重组蛋白的SUMO1、SUMO2或SUMO3标签。

rSENP2不识别特定的氨基酸序列,而是高度特异性地识别人源SUMO1/2/3三维结构特征,并在其尾部QTGG/X氨基酸残基之间进行高效酶切,释放成熟形式的SUMO1/2/3,可用于体外去SUMO化修饰反应或移除融合表达的重组蛋白的SUMO标签。

本产品N端带有His-tag,可以通过相应的抗体检测或通过镍柱吸附去除。

类泛素蛋白修饰分子(Small ubiquitin-like modifier, SUMO),也被称为泛素样修饰因子小蛋白、泛素样小分子修饰因子或小泛素相关修饰物,是一个广泛存在于真核生物的蛋白家族。在人体中共有4种SUMO:SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4,长度约100aa,理论分子量约12kDa,在氨基酸水平SUMO1与SUMO2的相似度为43%,SUMO2与SUMO3的相似度为96%,SUMO2与SUMO4的相似度为87% [1]。与泛素化(Ubiquitination)类似,SUMO通过类泛素蛋白(Ubiquitin-like proteins, Ubls)活化酶(Ubl activating enzyme, E1)、结合酶(Ubl conjugating enzyme, E2)和连接酶(Ubl protein ligase, E3)共价连接到特定蛋白的赖氨酸上,这一过程被称为SUMO化修饰(SUMOylation)。SUMO化修饰是一种翻译后修饰,参与细胞的调控,如细胞内转运、转录调控、细胞凋亡、蛋白质稳定性、压力应激和细胞周期等的调控等[2]。

人体中共有7种SENPs (Sentrin-specific proteases):SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7和SENP8,其中SENP8作用于泛素家族成员NEDD8,其余6种SENPs可以识别、切割并释放成熟形式的SUMO1/2/3用于SUMO化修饰,也可以去SUMO化修饰,即将连接到特定蛋白赖氨酸上的SUMO1/2/3切除(图1) [3]。碧云天的SUMO Protease (P2312) 是一种来自 Saccharomyces cerevisiae的高活性的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl protease) Ulp1 (Ubiquitin-like protein-specific protease 1)基因片段的重组表达蛋白,可以水解SUMO羧基端(C端) x-Gly-Gly-x肽段中Gly-Gly后的肽键,和本产品识别的SUMO标签有所不同,不能相互替换。同时本产品和SUMO Protease (P2312) 也都不能切割SUMOEU1标签。

图1. 人源SENPs加工处理SUMO1/2/3和去SUMO化修饰示意图。

SUMO3标签(SUMO3-tag)融合于目的蛋白N端已广泛应用于大肠杆菌体系的重组蛋白表达纯化,SUMO3标签作为分子伴侣辅助融合目的蛋白的折叠,增加重组蛋白的表达量,改善溶解性,保护目的蛋白不被降解。SUMO3标签与GST (Glutathione S-transferase)、MBP (Maltose binding protein)、Trx (Thioredoxin)、NusA (Transcription termination anti-termination factor)和DsbA (Protein disulfide isomerase I)等常用融合标签相比体积更小,而且不需要在融合标签和目的蛋白之间添加TEV (Tobacco etch virus)、EK (Enterokinase)或IIa (Thrombin)等蛋白酶酶切位点。SUMO3标签三维结构可以被rSENP2高特异性地识别,并在其尾部2个连续的Gly氨基酸残基处高效酶切,从而释放融合表达的目的蛋白,便于SUMO3标签的移除[4,5]。碧云天生产的重组SENP2蛋白酶(His-tag)酶切SUMO3标签融合蛋白的效果参考图2。

重组SENP2蛋白酶(His-tag) (P2313)酶切SUMO3标签融合蛋白的效果图。在20μl反应体系中,加入10µg SUMO3标签融合蛋白及1μl经100倍稀释的重组SENP2蛋白酶(His-tag),37℃孵育1小时后,加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289),混匀后95℃加热5分钟,使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0520)进行电泳检测并使用BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异,图中效果仅供参考。

本产品的基本信息如下表:

蛋白信息(About this protein)
名称(Name) 重组SENP2蛋白酶(His-tag)
别名(Synonyms) SUMO Protease 2, Sentrin/SUMO-specific protease 2, Axam2, SMT3-specific isopeptidase 2, KIAA1331
分子量(kDa) 26.8kDa
外观(Physical appearance) 液体
活性(Biological activity) 10U/μl or 100U/μl
活力单位(Unit definition) One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 90µg of SUMO3-EGFP protein in 1 hour at 37℃, to the extent that the accumulation of SUMO3-tag and EGFP as determined by SDS-PAGE.
浓度(Concentration) ~0.1mg/ml or ~1mg/ml
纯度(Purity) ≥95% by SDS-PAGE, other protease activity not detected.
储存液(Storage buffer) 5mM Tris (pH7.4), 250mM NaCl, 5mM DTT, 50% Glycerol
产品用途(Applications) rSENP2常用于移除融合蛋白的SUMO3标签;也可高度特异性地识别人源SUMO1/2/3三维结构特征,并在其尾部QTGG/X氨基酸残基之间进行高效酶切释放成熟形式的SUMO1/2/3;也可于体外去SUMO化修饰(DeSUMOylation)反应。

rSENP2最佳酶切温度为37℃,在较宽的pH范围(6.0-10.0),较宽的温度范围(2-37℃),较宽的离子强度范围(0-1M NaCl,0-500mM Imidazole)内均具有较高的酶活性。在实际操作过程中,建议4℃酶切过夜以尽可能保持重组蛋白的活性。rSENP2在0.5-2mM DTT存在的情况下酶活性更高,建议酶切体系中加入适当浓度的DTT以提高酶切效率。

rSENP2的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine protease inhibitor)如PMSF、AEBSF、Bestatin、Pepstatin、E-4、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等,可以显著抑制rSENP2的酶活力。

本产品用于移除重组蛋白SUMO3标签酶切反应时,如果按照1mg SUMO3标签融合的重组蛋白使用1μl rSENP2 (100U/μl)在4℃酶切过夜,本产品的500U、2KU、10KU和50KU包装,分别可用于约5mg、20mg、100mg和500mg带有SUMO3标签融合重组蛋白的酶切。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
P2313-500U rSENP2 (His-tag, 10U/μl) 50μl
P2313-2KU rSENP2 (His-tag, 100U/μl) 20μl
P2313-10KU rSENP2 (His-tag, 100U/μl) 100μl
P2313-50KU rSENP2 (His-tag, 100U/μl) 500μl
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,两年有效。

注意事项:

本产品含50%甘油,-20℃保存不会冻结。须避免-80℃保存,冻融可能会降低本产品的酶活性。

本产品较为粘稠,吸取时需注意取样量准确,加样后请注意充分吹打混匀,避免产生气泡。

请仔细核对所使用的SUMO标签是否适合本产品。不同的SUMO标签可能需要使用不同的相应蛋白酶的。

本产品的酶活性与SUMO3标签和目的蛋白形成的融合蛋白的空间结构有较大的相关性,实测对于一些SUMO3标签融合蛋白的活性可以达到说明书标注的活性,但对于某些UMO3标签融合蛋白的酶切活性会差别比较大。对于遇到本产品酶活性相对较低的情况,需要大幅度加大酶的用量。如果希望获得更高的酶切活性,此时建议在许可的范围内适当增减目的蛋白与SUMO3标签连接处的氨基酸序列,以获得更好的酶切效果。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.酶切条件的优化:由于不同SUMO3标签融合的重组蛋白具有不同的特性,为获得比较理想的实验效果,建议对酶和待酶切的SUMO3标签融合蛋白的使用比例进行适当优化,按照如下步骤摸索rSENP2的理想用量。
a.取1μl rSENP2 (100U/μl)加入到99μl Reaction Buffer (需用户自备)中,将rSENP2稀释至1U/μl。
注:由于rSENP2在较宽的pH范围(6.0-10.0),较宽的温度范围(2-37℃),较宽的离子强度范围(0-1M NaCl,0-500mM Imidazole)内均具有较高的酶活性,因此对Reaction Buffer组分不作特定限制,但是在0.5-2mM DTT存在的情况下rSENP2的酶活性更高,可根据实验需要决定酶切体系中是否加入适当浓度的DTT。
b.请参考下表在1.5ml离心管中配制反应体系。
Component Volume
SUMO3-tag Protein (10μg) xμl
rSENP2 (1U/μl) 0, 1, 5 or 10μl
Reaction Buffer To 20μl
c.进行酶切反应。温度与时间可以视情况进行适当调整,具体请参考下表。
Temperature Time
4℃ overnight
16℃ 4h
25℃ 2h
37℃ 1h
d.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289),混匀后95℃加热5分钟,使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0520)进行电泳检测并使用考马斯亮蓝(P0017F)染色。
e.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶,SUMO3标签被完全切除是比较理想的rSENP2酶用量,可按照等比例放大应用到后续的酶切反应中。
f.如按照上述操作,SUMO3标签没有被完全切除,可以尝试增加rSENP2酶用量,延长酶切时间或提高酶切温度,以获得最佳的酶切效果。
2.酶切与纯化。后续可以按照上述优化的反应条件,放大反应体系进行目的蛋白SUMO3标签的切除反应。反应结束后,可以通过镍柱结合去除切除下来的带有His标签的SUMO标签,以及带有His标签的本产品重组SENP2蛋白酶,从而获得高纯度的去除了SUMO标签的目的蛋白。也可以对于同时带有His标签的SUMO3标签的融合表达蛋白进行在柱酶切,即在镍柱或GST柱结合带有His标签的SUMO3标签的融合蛋白时,进行rSENP2 (His-tag)的酶切,酶切后如果镍柱容量足够,rSENP2 (His-tag)和酶切下来的带有His标签的SUMO3标签都会结合在镍柱上,仅目的蛋白会被洗脱下来。
参考文献:
1.Reverter D, Lima CD. Nat Struct Mol Biol. 2006. 13(12):1060-8.
2.Hay RT. SMol Cell. 2005. 18(1):1-12.
3.Nayak A, Müller S. Genome Biol. 2014. 15(7):422.
4.Marblestone JG, Edavettal SC, Lim Y, Lim P, Zuo X, Butt TR. Protein Sci. 2006. 15(1):182-9.
5.Butt TR, Edavettal SC, Hall JP, Mattern MR. Protein Expr Purif. 2005. 43(1):1-9.
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