P0603碧云天生产的SABC-AP Kit (IHC, ICC, Blotting & ELISA)是基于Streptavidin-Biotin Complex (SABC)信号放大系统而研制的用于免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)、免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)、Western、Northern、Southern、EMSA等印迹(blotting)检测以及ELISA等基于生物素标记的各种高灵敏度检测。
本试剂盒检测灵敏度高。与常规的检测方法相比，由于本试剂盒采用了SABC信号放大系统，检测灵敏度显著提高，通常检测灵敏度比常规方法可以提高约5-10倍。常规方法检测信号过弱时，强烈推荐尝试本试剂盒。
本试剂盒特异性强、背景低。本试剂盒采用了比Avidin特异性更强、背景更低、灵敏度更高的Streptavidin。Streptavidin (链霉亲和素)是从Streptomyces adidinii 中纯化获得的一种分子量为66kD的四聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子，其对生物素的解离常数(Kd, dissociation constant)可达10-15M，比通常抗原抗体的亲和力高约100万倍，可以确保与生物素高度专一地结合。Streptavidin与鸡蛋清来源的Avidin (亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性，但Streptavidin等电点几乎为中性(pI=6.0-6.5)，其在中性条件下几乎不带电荷。而Avidin的pI=10.5，在中性条件下带正电荷。因此Streptavidin比Avidin的非特异性结合更低，检测灵敏度更高。
检测原理：参考图1，组织、细胞、转移到膜上的或者结合于多孔细胞培养板上的抗原先与一抗结合，后者再与生物素标记的二抗结合；按照适当比例将Streptavidin和生物素标记的碱性磷酸酶(Biotin-labeled Alkaline Phosphatase, Biotin-AP)混合，形成网络状的SABC-AP (Streptavidin-Biotin Complex containing AP)复合物；接着二抗上标记的生物素再与SABC-AP结合，加入AP底物进行显色即可检测到相应的信号。其中Streptavidin和Biotin-AP混合后形成网络状复合物是信号能被放大的关键，相当于一个待检测的生物素分子通过SABC-AP复合物的识别最终可以由很多个AP分子来显示其信号，从而达到了信号放大的效果。

图1. 本试剂盒的检测原理图。

本试剂盒用于IHC、ICC或Blotting时，可以配制成100ml的SABC工作液。按照IHC和ICC每个样品需要使用100μl的SABC工作液计算，本试剂盒可用于1000个样品的检测。按照每张膜需10ml SABC工作液计算，本试剂盒可用于10次的Blotting检测。本试剂盒用于ELISA检测时，可以配制成500ml SABC工作液。按照ELISA检测每个样品需要使用100μl的SABC工作液计算，本试剂盒可用于5000个样品的检测。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存，一年有效。4℃保存，一个月有效。
注意事项：
本试剂盒使用过程中所需的溶液不能含有碱性磷酸酶抑制剂，也不能加入可能含有生物素的溶液，如常规血清、脱脂奶粉、细胞培养液等，否则会降低本试剂盒的检测灵敏度。
任何与液体孵育有关的步骤都需要确保液体能很好地覆盖样品。样品没有被液体充分覆盖而最终出现发干的情况，会导致染色不能正常进行。
实验所需缓冲液宜新鲜配制。长期放置的缓冲液可能会因为微生物污染，而导致检测效果的下降。
本试剂盒中的两种试剂需配套使用，切勿与其它试剂混用。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 参考表1配制SABC工作液
表1. SABC工作液配制表

注1：为确保充分形成Streptavidin-Biotin Complex，刚配制后必须室温至少放置30min后才能使用。
注2：配制好的SABC工作液必须在24h内使用完毕。
注3：SABC稀释液：除ELISA检测外，推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液；ELISA检测推荐使用P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液。通常宜选择有一定封闭能力的SABC稀释液，这样检测结果的背景通常会更低。
2. 免疫组化染色(IHC)
a. 需用户自行准备的试剂
(a)洗涤液(推荐使用碧云天的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗涤液)。
(b)固定液：4%多聚甲醛(推荐使用碧云天的P0098免疫染色固定液)。
(c)封闭液(推荐使用碧云天的P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液或P0102免疫染色封闭液)。
(d)一抗。
(e)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0262 QuickBlock™免疫染色一抗稀释液或P0103免疫染色一抗稀释液)。
(f)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。
(g)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。
(h)BCIP/NBT显色液(推荐使用碧云天的C3206 BCIP/NBT显色试剂盒)。
b. 染色方法
(a)按照常规方法制备石蜡或冰冻切片并灭活内源性碱性磷酸酶(推荐使用碧云天的P0100C内源性碱性磷酸酶封闭液(20X)，需参考产品说明书将其加入到碱性磷酸酶底物溶液中进行封闭)。
(b)抗原的修复：根据不同的抗原和切片的种类，选择把切片放置在适当的抗原修复液中进行抗原修复(推荐使用碧云天的P0081/P0083/P0085/P0086/P0088/P0090/P0092相关抗原修复液)。
(c)洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
(d)滴加封闭液封闭组织切片10-60min。使用P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。
(e)滴加一抗工作液，室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1-2h (为改善染色效果，可以4℃孵育过夜)。
(f)洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
(g)滴加生物素标记二抗工作液，室温缓慢摇动孵育30-60min或静止孵育1-2h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
(h)用洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
(i)滴加100μl的SABC工作液，室温缓慢摇动孵育30min或静止孵育1h。
(j)洗涤液洗涤组织切片5min×4次。
(k)滴加约100μl BCIP/NBT显色工作液，确保能充分覆盖样品。室温(约25℃)避光孵育约3-15min，至显色达到预期效果即可去除BCIP/NBT显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次以终止显色反应。
3. 免疫细胞化学染色(ICC)
a. 需用户自行准备的试剂
(a)洗涤液(推荐使用碧云天的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗涤液)。
(b)固定液：4%多聚甲醛(推荐使用碧云天的P0098免疫染色固定液)。
(c)封闭液(推荐使用碧云天的P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液或P0102免疫染色封闭液)。
(d)一抗。
(e)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0262 QuickBlock™免疫染色一抗稀释液或P0103免疫染色一抗稀释液)。
(f)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。
(g)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。
(h)BCIP/NBT显色液(推荐使用碧云天的C3206 BCIP/NBT显色试剂盒)。
b. 染色方法(以6孔板为例)
(a)细胞固定：去除培养液，用PBS洗涤细胞1次。每孔加入1ml固定液。固定10min后去除固定液，用洗涤液洗涤3次。
(b)细胞打孔：如果上一步的洗涤使用的是碧云天的P0106 免疫染色洗涤液等或其它含有0.1% Triton X-100的洗涤液可以忽略本步骤。否则每孔加入1ml含0.1%的Triton X-100的适当洗涤液，室温静置5min后去除洗涤液。
(c)内源性碱性磷酸酶的灭活：按照常规方法灭活内源性碱性磷酸酶(推荐使用碧云天的P0100C内源性碱性磷酸酶封闭液(20X)，需参考产品说明书将其加入到碱性磷酸酶底物溶液中进行封闭)。
(d)加入1ml封闭液，室温封闭10-60min。使用P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。
(e)去除封闭液，每孔加入0.5-1ml一抗工作液，室温缓慢摇动孵育1h或静止孵育1-2h (为改善染色效果，可以4℃孵育过夜)。
(f)每孔加入1ml洗涤液，室温缓慢摇动或静止放置洗涤5min×4次。
(g)吸尽洗涤液，每孔加入0.5-1ml生物素标记二抗工作液，室温缓慢摇动孵育30-60min或静止孵育1-2h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
(h)每孔加入1ml洗涤液，室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。
(i)每孔加入500μl SABC工作液，室温孵育30min。
(j)每孔加入1ml洗涤液，室温缓慢摇动或室温静止放置洗涤5min×4次。
(k)每孔加入500μl BCIP/NBT工作液，室温(约25℃)避光孵育约3-15min，至显色达到预期效果即可去除BCIP/NBT显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次以终止显色反应。显色期间，可以在显微镜下观察显色情况，以确定继续显色还是终止显色反应。

图2. Hela细胞Tubulin免疫染色效果图。A. 阴性对照组(不加一抗)。B. SABC-AP实验组。C. AP标记二抗对照组。

4. Western Blot
a. 需用户自行准备的试剂
(a)封闭液(推荐使用碧云天的P0252 QuickBlock™ Western封闭液或P0023B Western封闭液)。
(b)洗涤液(推荐使用碧云天的P0023C/P0023C3/P0023C6 Western洗涤液)。
(c)一抗。
(d)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0256 QuickBlock™ Western一抗稀释液或P0023A Western一抗稀释液)。
(e)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。
(f)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0258 QuickBlock™ Western二抗稀释液或P0023D Western二抗稀释液)。
(g)BCIP/NBT显色液(推荐使用碧云天的C3206 BCIP/NBT显色试剂盒)。
b. 检测方法
(a)SDS-PAGE电泳、转膜后，用封闭液室温缓慢摇动封闭10-60min。使用P0252 QuickBlock™ Western封闭液仅需封闭10min，普通封闭液封闭60min。
(b)将膜置于一抗工作液中，室温缓慢摇动孵育1h (为提高检测敏感度，可以考虑4℃缓慢摇动孵育过夜)。
(c)洗涤液洗涤5min×4次。
(d)将膜置于生物素标记二抗工作液中，室温缓慢摇动孵育1h。孵育期间，参考表1配制SABC工作液，配制后应室温至少放置30min后才可以使用。
(e)洗涤液洗涤5min×4次。
(f)将膜置于SABC工作液中，室温缓慢摇动孵育30min。
(g)洗涤液洗涤5min×4次。
(h)如果进行BCIP/NBT显色：将膜置于适量的BCIP/NBT工作液中，一般室温避光孵育3-15min即可，去除BCIP/NBT显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应；将膜自然风干后避光保存。BCIP/NBT显色的检测效果参考图3。
图3.SABC法BCIP/NBT显色检测效果图。常规法采用AP标记二抗，SABC法采用本试剂盒。样品为Hela细胞总蛋白，上样量如图中所示。一抗是AT819 Tubulin抗体，稀释比例为1:1000。注：SABC法可以达到普通ECL发光试剂的检测灵敏度。但除非条件所限，否则我们更推荐使用碧云天的P0018A BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒)和HRP标记二抗进行Western检测。使用BeyoECL Star检测时的灵敏度比用本试剂盒方法还要高约5倍或更多。
5. ELISA
a. 需用户准备的试剂
(a)包被缓冲液：0.2M碳酸氢盐缓冲液，pH 9.4。
(b)洗涤液：PBS, pH7.4, 0.05% Tween-20, 0.1% BSA (推荐使用碧云天的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗涤液)。
(c)封闭液：PBS, 1% BSA (推荐使用碧云天的P0260 QuickBlock™免疫染色封闭液或P0102免疫染色封闭液)。
(d)抗原溶液：溶于包被缓冲液。
(e)一抗。
(f)一抗稀释液(推荐使用碧云天的P0103免疫染色一抗稀释液)。
(g)二抗(推荐根据样品的种属特异性选购碧云天的A0279/A0288生物素高效标记二抗，其推荐的稀释比例均为1:100)。
(h)二抗稀释液(推荐使用碧云天的P0267 QuickBlock™免疫组化染色二抗稀释液或P0110免疫染色(非荧光)二抗稀释液)。
(i)酶反应底物：2mg/ml对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny phosate, pNPP)溶于100mM NaHCO₃, pH 9.5, 10mM MgCl₂。推荐使用碧云天的P0321 碱性磷酸酶检测试剂盒。
b. 检测方法(以96孔板为例)
(a)每孔中加入50-200μl的抗原溶液，室温孵育1h或4℃过夜。
(b)去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体，每孔用200μl洗涤液洗涤3次，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。
(c)每孔加入200μl的封闭液室温孵育60min。
(d)去除孔中液体并在吸水纸上拍干残余液体，加入100μl的一抗工作液，室温孵育30min。
(e)每孔用200μl洗涤液洗涤3次，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干残余液体。
(f)每孔加入100μl生物素标记二抗工作液，室温孵育30min (此时应配制SABC工作液，配制方法参考表1)。
(g)每孔用200μl洗涤液洗涤3次，然后加入200μl洗涤液孵育5min。
(h)去除孔中的液体并在吸水纸上拍干，每孔加入100μl SABC工作液，室温孵育30min。
(i)每孔用200μl洗涤液洗涤3次，然后加入200μl洗涤液孵育5min，去除孔中的液体并在吸水纸上拍干。
(j)每孔加入200μl酶反应底物(推荐使用碧云天的P0321碱性磷酸酶检测试剂盒)，室温避光孵育3-30min或更长时间，直至显色至预期深浅，测定吸光度。可以根据实验需要考虑加入显色终止试剂，例如0.5M Na₂CO₃，并在400-415nm测定吸光度。

常见问题：
1.背景太深
a.考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选择碧云天推荐的封闭液进行封闭。
b.内源性蛋白结合的生物素，内源性凝集素以及离子间的相互作用都会使背景显色加深。针对内源性蛋白结合的生物素可采用生物素检测封闭液进行封闭(推荐使用碧云天的P0101生物素检测封闭试剂盒)；对于内源性凝集素可在SABC稀释液中加入0.2M的ɑ-甲基甘露糖进行封闭；而对于离子间的相互作用带来的干扰，可以通过把SABC试剂溶于含有0.5M NaCl的缓冲液中来消除。
c.对于免疫染色，需注意用适当方法灭活内源性碱性磷酸酶。
d.考虑适当降低一抗或二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或适当延长洗涤时间也会有所帮助。
2.没有信号或信号太弱
a.评估样品中待检测的蛋白的表达水平是否足够高，最好能选择高表达的样品作为阳性对照。
b.考虑适当提高一抗或二抗的浓度。
c.适当延长显色或发光时间，另外须确定抗原修复对于所使用的一抗是否是必需或有效的。

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