碧云天研发的DNase I残留检测试剂盒(DNase I Residue Detection Kit or Fluorometric DNase I Assay Kit)，是一种用荧光法快速高灵敏检测样品中DNase I及其它脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)残留量的试剂盒。

脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶(RNase)类似，广泛存在于实验环境和生物物体中，由于核酸酶能够降解核酸，因此核酸酶的存在会对许多实验造成干扰[1]。在处理过的生物制品中，这些核酸酶微量残留会对后续生物制品的应用造成一定的影响。文献中常见的检测DNase I的方法通常耗时长，并且检测灵敏度比较低。

本试剂盒检测灵敏度高，可以检测低达约6×10^-4 U的DNase I。本试剂盒也被称为脱氧核糖核酸酶I残留检测试剂盒、DNase残留检测试剂盒、脱氧核糖核酸酶I活性荧光检测试剂盒、DNA酶I活性荧光检测试剂盒或荧光法DNase I活性检测试剂盒。

DNase I即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是最常见的DNase，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端[2]。

DNase I残留检测试剂盒采用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如图1所示。DNase I底物(DNase Substrate)是一种合成的DNA寡核苷酸探针，其一端具有VIC荧光基团(Fluorophore)又称供体(Donor)，另一端具有BHQ1淬灭基团(Quencher)又称受体(Acceptor)。这两个基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。VIC和BHQ1被连接到DNase I的底物两端。当该底物被DNase切割后，DNA底物的首尾两端分离，两个基团分开，VIC的荧光不再被BHQ1淬灭，即可检测到VIC的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测DNase酶活性。VIC的最大激发波长为535nm，最大发射波长为556nm。试剂盒内提供DNase I标准品，可以通过设置标准曲线，计算出样品中DNase I的残留量。本试剂盒也可以检测其它的非DNA序列特异性的DNA内切酶。

图1. 碧云天DNase I残留检测试剂盒检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，样品用量少。本试剂盒中提供了DNase I作为阳性对照，便于检测体系的建立。同时对DNase I底物探针进行了优化，灵敏度高，可以检测到低达约6×10^-4 U的DNase I，检测灵敏度高于常规同类产品。本试剂盒用于DNase I标准品的检测结果参考图2。

图2. 碧云天DNase I残留检测试剂盒对DNase I标准品的检测效果。本试剂盒检测不同量的DNase I的荧光值，测定时间为20分钟。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒适用范围广，使用灵活，检测速度快。本试剂盒不仅可以用于检测DNase I，也可检测其它的DNase，包括可切割单链和双链DNA的核酸酶，相对于ELISA法更简单、更快速、更准确。已通过实验验证本试剂盒可以用于检测Benzonase类超级核酸酶、T4 DNA聚合酶、T5 Exonuclease、Micrococcal nuclease、Mung Bean Nuclease、S1 Nuclease等酶的相对活性。本试剂盒采用一步法检测，简单快速，全程仅需约20分钟即可完成。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装P0346S可以进行100次检测，中包装P0346M可以进行500次检测。

包装清单：
保存条件：

-20℃保存，一年有效。其中P0346-3 5X DNase I Substrate须避光保存。

注意事项：

由于环境中存在的DNase会干扰本试剂盒的检测，建议在超净工作台或生物安全柜等相对洁净的环境中进行DNase I的残留检测，以免待检样品受环境中DNase的影响。

10X Reaction Buffer、Nuclease-free Water和5X DNase I Substrate需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。DNase I (1U/μl)使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

请确保样品pH值在7-8之间，或加入样品后反应体系的pH值在7-8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

本试剂盒可能对一些核酸酶不适用，例如，Klenow Fragment和Phi29 DNA聚合酶。一般情况下，本试剂盒中提供的10X Reaction Buffer对大多数核酸酶是通用的，但也存在对一些特定的酶不适用的情况。如有必要请用特定核酸酶的缓冲液对样品进行稀释和反应。

使用本试剂盒检测时请注意防止试剂被DNase污染，如有必要，每次实验可使用碧云天的RNase and DNase Away(R0123)清除环境中存在的DNase。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.试剂盒的准备。 a.将10X Reaction Buffer、5X DNase I Substrate和Nuclease-free Water平衡至室温后分别混匀备用。DNase I (1U/μl)存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.将10X Reaction Buffer用Nuclease-free Water稀释为1X，例如取100μl 10X Reaction Buffer，加入900μl Nuclease-free Water，混匀即得1ml的1X Reaction Buffer。
c.将5X DNase I Substrate用1X Reaction Buffer稀释为1X，例如取20μl 5X DNase I Substrate，加入80μl 1X Reaction Buffer，混匀即得100μl的1X DNase I Substrate。
2.样品的准备。
如果样品为液体，并且其中不存在明显抑制DNase I活性的物质，可以直接使用样品进行检测。如果样品中的DNase I活性过高，为了进行比较精确的定量，可以用1X Reaction Buffer适当稀释样品。如果样品中存在抑制DNase I活性的物质，可以考虑通过透析、超滤等方法去除抑制物。器皿等表面的DNase I的残留，可以使用拭子取样后在1X Reaction Buffer中浸泡制备成液体样品。
3.DNase I标准曲线的设置： 将DNase I (1U/μl)用1X Reaction Buffer稀释至适当的浓度梯度。初次检测时可设置为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4mU/μl，分别取10μl加入96孔板中，此时，DNase I量分别为0、0.000625、0.00125、0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04U。也可自行设置适宜的DNase I浓度进行标准曲线的设定。
4.检测体系的设置：
参照下表依次加入试剂盒各组分及样品。初次检测时，待测样品可进行适当稀释。

Reagent	Blank Control	Positive Control	Sample
1X Reaction Buffer	90μl	80μl	80μl
DNase I	0	10μl	0
Sample	0	0	10μl
1X DNase I Substrate	10μl	10μl	10μl
Total Volume	100μl	100μl	100μl

注：为获得更加可靠的检测结果，建议每个样品设置平行孔或3个复孔。
5.检测。
a.振荡混匀1-2分钟，确保混合充分。
b.混匀后立即使用荧光酶标仪进行荧光测定。设置荧光酶标仪温度为37℃，激发波长为535nm、发射波长为556nm，每5分钟或10分钟读取一次数值。
注1：连续测定的时间可以根据待测样品中DNase I含量进行适当调整，但是需确保获得6个点以上的数据。对于DNase I的含量较高的样品，建议测定总时间为20分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟；对于DNase I的含量很低的样品，可以延长测定总时间为1小时，对应的测定间隔时间设为5或10分钟。
注2：如果荧光酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的实验条件偏低的程度会有所不同。
6.计算。
通过绘制的标准曲线及样品荧光强度值进行样品中DNase I残留量的计算。
参考文献：
1.Kolarevic A, Yancheva D, Kocic G, Smelcerovic A. Eur J Med Chem. 2014. 88:101-11.
2.Fujihara J, Yasuda T, Ueki M, Iida R, Takeshita H. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2012. 163(3-4):263-73.
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