碧云天研发生产的新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型) (Enhanced 2019-nCoV Mpro/3CLpro Inhibitor Screening Kit)是一种利用荧光检测，简单、快速、灵敏地用于新型冠状病毒Mpro/3CLpro蛋白酶抑制剂高通量筛选的试剂盒。本试剂盒使用的是和天然新型冠状病毒主蛋白酶(main protease, 简称Mpro，也称3C-like protease，简称3CLpro)的氨基酸序列完全相同的新型冠状病毒Mpro/3CLpro蛋白酶，没有任何额外的标签和氨基酸，确保筛选结果更加真实可信。
本试剂盒使用MCA荧光底物，荧光信号约为新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(P0312)的2倍，筛选效果更佳。对于筛选出来的有效的抑制剂，本试剂盒也可以和新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(P0312)相互验证。
2019年底由新型冠状病毒引起的肺炎疫情，从2020年初开始在全球大流行，感染病例快速上升，引发全球关注。该病毒被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV，被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠状病毒感染导致的肺炎，被世界卫生组织命名为2019冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019, COVID-19），通常称为新型冠状病毒肺炎，简称“新冠肺炎”。
新型冠状病毒(2019-nCoV)属于单正链的RNA病毒，与SARS-CoV以及MERS-CoV具有较高的同源性，该病毒感染进入宿主细胞后，在宿主细胞的帮助下，其遗传物质RNA的ORF1a/b首先翻译表达出两条多聚蛋白前体(pp1a和pp1ab)，多聚蛋白前体在主蛋白酶(main protease, 简称Mpro)和木瓜样蛋白酶(papain like proteases)的作用下发生分子内的切割产生多个非结构蛋白。Mpro也被称为3C-like protease (3CLpro)，因为其切割位点的特异性与微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，两者并称为Mpro/3CLpro。多聚蛋白前体产生的非结构蛋白参与了病毒亚基因RNA和四个结构蛋白(envelope/E蛋白、membrane/M蛋白、spike/S蛋白和nucleocapsid/N蛋白)的产生，进而完成子代病毒的繁衍与释放。由于Mpro蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至关重要的作用，且人体内没有同源蛋白，故Mpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点，自2003年SARS爆发后，已有大量基于Mpro结构为基础的抗SARS药物的研究。Lopinavir(洛匹那韦)与Ritonavir(利托那韦)等抗HIV药物也是作用于类似的蛋白酶靶点，并在临床上得到很好的验证。同时，Mpro在冠状病毒中保守性高，筛选出的Mpro抑制剂具有一定程度的广谱抗冠状病毒能力，甚至可能用于猪冠状病毒等相关的其它动物疾病的治疗。
新型冠状病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型)采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶的天然底物(Substrate)的两端，即MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2。当2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶没有切割该底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA荧光而导致检测不到荧光；当该底物被2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶的酶活性。如果在反应体系中加入2019-nCoV Mpro/3CLpro的抑制剂(Inhibitor)，荧光的生成会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白酶抑制剂的抑制效果。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。本试剂盒的检测原理请参考图1。
图1. 新型冠状病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型)检测Mpro/3CLpro酶活性的原理图。
本试剂盒抑制剂筛选结果更加真实可信。2019-nCoV Mpro/3CLpro与SARS-CoV的Mpro/3CLpro只差12个氨基酸，同源性大于96%，两者结构基本一致，因此2019-nCoV Mpro/3CLpro抑制剂筛选时，使用和天然的2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白序列完全相同的重组蛋白至关重要。碧云天通过2019-nCoV Mpro/3CLpro和其特异性底物，开发出新型冠状病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(增强型)。本试剂盒中使用的2019-nCoV Mpro/3CLpro是碧云天采用自主研发的PerfectProtein™蛋白表达技术平台纯化而来，使表达的重组2019-nCoV Mpro/3CLpro蛋白没有任何额外的标签，没有任何一个额外的氨基酸，确保与2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致。采用本试剂盒用于新型冠状病毒抑制剂的筛选，可确保筛选获得的抑制剂更加真实可信，避免因为存在的额外氨基酸而筛选出“假阳性”的抑制剂。
本试剂盒兼容性强。常用溶剂如DMSO、无水乙醇、甘油等对本试剂盒的检测结果影响较小，实测反应体系中DMSO或无水乙醇、甘油含量达10%时对检测结果基本没有影响，含量达20%时孵育10分钟的信号下降不超过10%；去垢剂如Triton X-100等的含量在低于0.9%时孵育10分钟基本无影响。
本试剂盒信号稳定性好，信号更强。孵育5分钟后，信号即趋于稳定并在20分钟内几乎没有变化。同时，本试剂盒100%酶活性的信号值约为新型冠状病毒Mpro/3CLpro抑制剂筛选试剂盒(P0312)的2倍，确保有更宽泛的信号范围用于抑制剂的筛选，效果更佳。
本试剂盒中提供了2019-nCoV Mpro/3CLpro、底物(Substrate)、阳性对照2019-nCoV Mpro/3CLpro抑制剂(Ebselen)，并且对2019-nCoV Mpro/3CLpro和底物的使用量进行了优化。不仅能检测出IC50很低的抑制剂，也能检测出IC50较高的抑制剂。本试剂盒提供了阳性对照Ebselen (依布硒)，公开发表的数据显示Ebselen在体外的IC50约为0.67μM，实测数据会略有偏差。
用于96孔板检测时，本试剂盒小包装P0315S可以进行100次检测，中包装P0315M可以进行500次检测。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0315S-1 | Assay Buffer | 30ml |
| P0315S-2 | 2019-nCoV Mpro/3CLpro | 100μl |
| P0315S-3 | Substrate | 400μl |
| P0315S-4 | Ebselen (10mM) | 20μl |
| — | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0315M-1 | Assay Buffer | 125ml |
| P0315M-2 | 2019-nCoV Mpro/3CLpro | 500μl |
| P0315M-3 | Substrate | 2ml |
| P0315M-4 | Ebselen (10mM) | 100μl |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃保存，一年有效。其中P0315-3 Substrate需避光保存。
注意事项：本产品说明书自2022年1月起启用新版本，请注意按照新版说明书进行相应操作。不同版本和不同批号的本产品可能存在Substrate的提供量和使用量不同的问题。
Assay Buffer、Substrate和Ebselen (10mM)需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。2019-nCoV Mpro/3CLpro在使用时应置于冰上。使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
请确保样品pH值在7-8之间，或确保加入样品后反应体系的pH值在7-8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。
待测抑制剂样品的溶剂可能会对检测产生干扰，推荐使用本试剂盒提供的Assay Buffer为溶剂配制、稀释样品，如样品必须用其它试剂配制、稀释，请进行一定的测试，并添加与样品等量的溶剂作为100%酶活性对照。经测试，反应体系中DMSO、无水乙醇浓度达10%时对检测结果没有影响，但仍然建议进行一定的预实验并尽量降低DMSO、无水乙醇等溶剂在反应体系中的浓度。
由于Ebselen (10mM)阳性对照抑制剂的水溶性不是很好，须使用DMSO进行稀释。
体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| 1个样品 | 5个样品 | 10个样品 | 20个样品 | |
| Assay Buffer | 90μl | 450μl | 900μl | 1.8ml |
| 2019-nCoV Mpro/3CLpro | 1μl | 5μl | 10μl | 20μl |
| 空白对照 | 100%酶活性对照 | 阳性抑制剂对照 | 样品 | |
| Assay Buffer | 91μl | - | - | - |
| Assay Reagent | - | 91μl | 91μl | 91μl |
| Ebselen溶液 | - | - | 5μl | - |
| 样品溶剂 | 5μl | 5μl | - | - |
| 待测样品 | - | - | - | 5μl |
