碧云天研发的SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法) (SignalUp™ Ultra Sensitive ELISA Assay Kit with Fluorescent HRP Substrate)是基于在辣根过氧化物酶(HRP)存在的条件下，过氧化物酶荧光底物ADHP与H2O2反应生成试卤灵(Resorufin)，从而对ELISA反应体系中的HRP进行增强型超敏荧光检测的试剂盒。
本试剂盒优化了相应的增敏试剂，在ELISA应用中检测HRP灵敏度比碧云天的同类产品SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(P0205)高约2-5倍，比常规TMB作为底物时提高20-50倍以上，这样可以大大减少珍贵样品的用量，并有可能检测一些因浓度过低而不能被常规显色方法检测的样品。在ELISA检测时，如果样品非常珍贵，或者待测目标分子因为浓度过低而不太容易被检测到时，强烈推荐使用本试剂盒。本产品和Thermo的QuantaRed™ Enhanced Chemifluorescent HRP Substrate相近。
常见的用于ELISA测定中检测HRP活性的底物多为显色底物，如TMB、OPD和ABTS等，需要进行吸光度的检测。这些底物的性能如检测灵敏度、动态范围等的差别较大。其中，TMB是目前最灵敏的显色底物之一，较其它几种显色底物有更好的检测灵敏度，并在ELISA检测中广泛应用[1]。但吸光度检测法无法对超过四个光学密度单位(Optical density, OD)进行准确定量，限制了ELISA检测的上限，而荧光法则不受影响，在检测仪器允许的情况下能够准确检测极高的荧光强度。更为重要的是，相对于吸光度检测法，荧光检测法更为灵敏，检测限范围也更宽[2]。
ADHP，即10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine，又名Amplex Red、Ampliflu™ Red、OxiRed Probe、Amplisyn Red或A6550，中文名为荧光红染料或10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪，CAS号为119171-73-2，是一种可以用于吸光度或荧光检测的过氧化物酶底物，更常用于荧光分析检测。ADHP是目前已知的用于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)和过氧化氢(H2O2)的检测最灵敏、最稳定的荧光探针之一。在HRP存在的情况下，ADHP与H2O2以1:1的化学定量比反应，生成高荧光的试卤灵(Resorufin)，其最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，并且在激发波长处有很强的可见光吸收，也可在A570检测吸光度[3]。在免疫学分析中，ADHP已经广泛地用来检测HRP。与其它商品化的HRP底物相比，如二氢荧光素和二氢罗丹明等， ADHP的本底荧光水平更低，受空气氧化的影响也较小。本试剂盒所使用的增敏试剂，可以有效增强ADHP的荧光，从而进一步提高荧光检测的灵敏度。本试剂盒的检测原理请参考图1。
图1.碧云天SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法)的检测原理图。图A为ADHP在HRP催化下生成试卤灵的反应。图B为试卤灵在pH为7.4的缓冲溶液中的吸收和发射光谱。Abs.: Absorption, 吸收; Em.: Emission, 发射。
本试剂盒检测背景低。反应生成的试卤灵的发射波长接近红光区(见图1B发射光谱)，此波长下生物样品自发荧光(位于波长较短的蓝绿光区)的干扰较小，使ADHP成为对生物样品中目标分子进行检测的理想底物。
本试剂盒检测范围广，灵敏度极高。本试剂盒显著提升了普通ELISA实验的检测范围，灵敏度远远高于TMB底物，比碧云天的同类产品SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(P0205)高约2-5倍。本试剂盒与P0205以及TMB检测信号对比参考图2。
图2.碧云天SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法)与碧云天同类产品SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒以及TMB法对96孔板中包被的不同浓度生物素标记二抗(Biotin-Ab)检测效果对比图。生物素标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0286)稀释至图中所示各浓度，对96孔板进行包被；辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)用PBS按1:10,000稀释后加入各反应孔中室温孵育30分钟；洗板后，分别加入100µl ADHP工作液(本试剂盒或P0205)或TMB显色液(ELISA HRP显色用) (P0209)，室温避光孵育10分钟。对使用本试剂盒和P0205试剂盒工作液的反应孔进行荧光检测，激发和发射波长分别设置为558nm和590nm；对TMB反应孔中加入TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸) (P0215)并在450nm检测吸光度。图A为使用各方法检测的标准曲线，生物素标记二抗浓度为横坐标，荧光强度(本试剂盒和P0205，左纵轴)或A450 (TMB, 右纵轴)为纵坐标。对曲线分别进行ELISA中常用到的四参数拟合(Four Parameter Logistic Regression, 4PL)，并用空白缓冲液信号均值加上三倍标准偏差对检测限(Limit of detection, LOD)进行计算，得出P0205检测限相比TMB显色体系提升约10倍，而本试剂盒比P0205的检测限进一步提高约4.5倍。图B为三种方法在各浓度的信号与背景信号比值，从图中可以看出荧光检测不受信号读取上限的限制，极大增加了信号-背景比(Signal-to-Background ratio, S/B ratio)，而本试剂盒比P0205在相同浓度下的信号-背景比又有进一步的提升，可使检测灵敏度得到提高。实测数据会因试剂、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
本试剂盒组分齐全，使用便捷。本试剂盒全套提供试剂，包括过氧化物酶底物ADHP (ADHP Substrate Solution)、稳定过氧化物溶液(Stable Peroxide Solution)、增强剂溶液(Enhancer Solution)和终止试剂(Stop Reagent)。用户只需简单混合并使用，无需额外准备缓冲液或溶解试剂。
本试剂盒反应可控。本试剂盒提供的反应终止试剂，可有效终止HRP催化荧光产物的生成，可至少获得1小时的稳定信号。本试剂盒终止液使用效果参考图3。
图3.碧云天SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法)反应终止液的使用效果图。在低(0.0001%)、中(0.002%)、高(0.01%)、极高(0.2%)四种浓度的生物素标记山羊抗小鼠IgG(H+L) (A0286)，即图A中的low/medium/high/ultra-high Biotin-Ab，包被的孔中加入1:10,000稀释的辣根过氧化物酶标记Streptavidin (A0303)，室温孵育30分钟；洗板后，分别加入100µl ADHP工作液，室温避光孵育10分钟后，进行同一浓度的生物素包被孔终止反应的平行实验：在反应孔中加入20µl反应终止液，对照孔不做处理；对各孔反应进行荧光检测跟踪，激发和发射波长分别设置为558nm和590nm，反应温度为25℃。图A为空白孔及低、中、高、极高四组生物素标记山羊抗小鼠IgG(H+L)浓度下反应孔荧光强度随时间的变化。图B为反应在终止和未终止情况下持续约1小时后的标准曲线。从图中可以看出，本试剂盒中的反应终止液能够有效终止HRP催化荧光产物的生成。实测数据会因试剂、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。w/o, without。
对于96孔板，按照每孔使用100μl ADHP工作液计算，本试剂盒小包装可以用于100个样品的检测，中包装可以用于500个样品的检测，大包装可以用于2000个样品的检测。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0207FT-1 | ADHP Substrate Solution (100X) | 50µl |
| P0207FT-2 | Stable Peroxide Solution (16X) | 330µl |
| P0207FT-3 | Enhancer Solution | 4.8ml |
| P0207FT-4 | Stop Reagent (2X) | 0.5ml |
| — | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0207S-1 | ADHP Substrate Solution (100X) | 100µl |
| P0207S-2 | Stable Peroxide Solution (16X) | 650µl |
| P0207S-3 | Enhancer Solution | 9.5ml |
| P0207S-4 | Stop Reagent (2X) | 1ml |
| — | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0207M-1 | ADHP Substrate Solution (100X) | 500µl |
| P0207M-2 | Stable Peroxide Solution (16X) | 3.3ml |
| P0207M-3 | Enhancer Solution | 48ml |
| P0207M-4 | Stop Reagent (2X) | 5ml |
| — | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P0207L-1 | ADHP Substrate Solution (100X) | 2ml |
| P0207L-2 | Stable Peroxide Solution (16X) | 13ml |
| P0207L-3 | Enhancer Solution | 190ml |
| P0207L-4 | Stop Reagent (2X) | 20ml |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃避光保存，一年有效。4℃避光保存，一个月有效。
注意事项：Stop Reagent (2X)三个月内使用效果最佳，如果要保存更长时间，须-80度保存，一年有效。
各溶液需平衡至室温(25℃左右)后再使用，溶液温度会影响反应的动力学。
各溶液中均含有空气敏感的组分，暴露时间过长容易失效，使用后，请盖紧瓶盖。
各溶液中均含有光敏组分，使用时注意避光，特别是配制好的ADHP工作液，使用前和使用中需严格避光。
可根据需要对ADHP Substrate Solution (100X)进行分装后保存。
使用过程中，各溶液在吸取过程中必须要更换枪头，否则相互污染后会导致逐渐失效，影响后续的使用效果。
检测时建议使用96孔黑板，例如碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。
Stop Reagent对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
在HRP浓度过高或反应时间过长时，生成的荧光产物试卤灵可能会因浓度过高而产生自猝灭现象(如图3A中0.2%浓度所示)。可通过调整HRP标记的检测抗体或Streptavidin浓度来优化检测范围。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| Reagent | 1 Sample | 10 Samples | 50 Samples | 100 Samples |
| Enhancer Solution | 92.75µl | 927.5µl | 4637.5µl | 9275µl |
| ADHP Substrate Solution (100X) | 1µl | 10µl | 50µl | 100µl |
| Stable Peroxide Solution (16X) | 6.25µl | 62.5µl | 312.5µl | 625µl |
| ADHP Working Solution | 100µl | 1ml | 5ml | 10ml |
| Problem | Possible Causes | Solution |
| 背景信号高 | HRP浓度过高 | 适当降低HRP标记的抗体或Streptavidin的浓度 |
| 包被板封闭不完全 | 调整封闭的时间和温度(例如室温封闭至少1小时，或在4℃下封闭过夜) | |
| 选择更合适的封闭液，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。 | ||
| 提高封闭液中的蛋白浓度 | ||
| (夹心法)捕获抗体和检测抗体非特异性结合 | 更换抗体对 | |
| 洗涤不充分 | 与HRP标记物孵育步骤后增加洗涤步骤或延长洗涤时间 | |
| 洗涤液中Tween-20可能造成干扰 | 在加入ADHP工作液前用不含Tween-20的洗涤液进行1-2次洗涤 | |
| 检测信号低 | 样品中待检测目标分子浓度过低 | 加入更多样品 |
|
捕获或检测抗体浓度低(夹心法) 一抗或二抗浓度低(其他方法) |
适当优化和提高相应抗体的浓度。 | |
| 激发或发射波长不在合适范围 | 使用接近荧光产物的最大激发和发射波长进行检测 | |
| 荧光显色反应时间不够 | 适当延长避光孵育时间 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| A0279 | 生物素高效标记山羊抗兔IgG(H+L) | 0.5ml |
| A0288 | 生物素高效标记山羊抗小鼠IgG(H+L) | 0.5ml |
| A0303 | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 0.2ml |
| P0209-100ml | TMB显色液(ELISA HRP显色用) | 100ml |
| P0209-500ml | TMB显色液(ELISA HRP显色用) | 500ml |
| P0215-100ml | TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸) | 100ml |
| P0215-500ml | TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸) | 500ml |
| P0217-100ml | TMB显色终止液(650nm, 无腐蚀性) | 100ml |
| P0603 | SABC-HRP Kit (IHC, ICC, Blotting & ELISA) | 1000次 |
| P0612 | SABC-HRP Kit with Anti-Mouse IgG (IHC & ICC) | 500次 |
| P0615 | SABC-HRP Kit with Anti-Rabbit IgG (IHC & ICC) | 500次 |
| P0205S | SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(HRP荧光法) | 100次 |
| P0205M | SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(HRP荧光法) | 500次 |
| P0205L | SignalUp™ ELISA超敏检测试剂盒(HRP荧光法) | 2000次 |
| P0207S | SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法) | 100次 |
| P0207M | SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法) | 500次 |
| P0207L | SignalUp™ ELISA特超敏检测试剂盒(HRP荧光法) | 2000次 |
