KCTD5基因敲除质粒
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产品编号 L09505
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¥ 999.00
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pLenti-KCTD5-sgRNA (KCTD5基因敲除质粒)是一种在动物细胞中可以同时表达Cas9、目的基因的sgRNA和puromycin抗性基因的质粒。用于在动物细胞中直接基于CRISPR/Cas9技术敲除目的基因,或者通过包装慢病毒后基于CRISPR/Cas9技术敲除目的基因。本质粒中sgRNA的有效性已经通过T7EI法的验证。

本质粒在细菌中为Amp抗性,全长约13,000bp。本质粒的关键图谱信息请参考图1。本质粒可直接转染细胞用于目的基因的CRISPR/Cas9敲除,以及通过puromycin筛选稳定细胞株;也可以与pMDLg、Rev及VSV-g共转HEK293T细胞进行重组慢病毒(lentivirus)的包装,然后再用于感染细胞或组织并进行目的基因的CRISPR/Cas9敲除。

图1. 表达sgRNA、Cas9和puromycin抗性的pLenti-sgRNA质粒关键图谱信息。

本质粒中的sgRNA基于碧云天研发的CRISPR/Cas9 sgRNA快速筛选和验证体系获得,sgRNA的有效性已经通过T7EI法验证。

本质粒用于实验时,建议同时选购无任何靶向的对照质粒pLenti-Control-sgRNA (L00011)或靶向GFP的对照质粒pLenti-GFP-sgRNA (L00013)

碧云天同时提供基于CRISPR/Cas9技术的KCTD5基因敲除的质粒(L09505 pLenti-KCTD5-sgRNA)慢病毒(L09506 KCTD5 Knockout Lentivirus)HEK293T细胞(L09507 KCTD5 Knockout HEK293T Cells)HEK293T敲除细胞的RIPA裂解液(L09508 KCTD5 Knockout HEK293T RIPA Lysate)HEK293T敲除细胞的Trizol裂解液(L09509 KCTD5 Knockout HEK293T Trizol Lysate)等产品,具体请在碧云天网站查询或在本产品网页点击相应产品。

KCTD5基因的基本信息如下:

Species Gene Symbol Gene ID GenBank Accession Transcript
Human KCTD5 54442 BC007314 NM_018992

 

About the gene
Official Symbol KCTD5
Previous Symbol -
Official Full Name potassium channel tetramerization domain containing 5
Synonyms FLJ20040
Location 16p13.3
Gene Type protein-coding gene
Uniprot ID Q9NXV2
Pathway/Library Ubiquitin Ligases Genes Library
Gene Summary Its interaction with CUL3 suggests that it may act as a substrate adapter in some E3 ligase complex (PubMed:18573101). Does not affect the function of Kv channel Kv2.1/KCNB1, Kv1.2/KCNA2, Kv4.2/KCND2 and Kv3.4/KCNC4 (PubMed:19361449). KCTD5_HUMAN,Q9NXV2
包装清单:
产品编号 产品名称 包装
L09505 pLenti-KCTD5-sgRNA 5µg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少两年有效。

注意事项:

碧云天拥有sgRNA序列的知识产权,如果需要sgRNA序列,请在订购后发送邮件向info@beyotime.com索取。sgRNA与质粒及其序列信息,未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。使用者在发表研究论文或结果时,应注明来源。

慢病毒包装使用的包装质粒,可以订购碧云天的Lentivirus Packaging Vectors Set A (L00002),包括pMDLg、Rev和VSV-g。

对于非目录产品的CRISPR基因敲除用的sgRNA表达质粒的定制,可联系碧云天技术服务service@beyotime.com

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 质粒的扩增和鉴定:
a. 扩增:请先取少量本质粒转化Stbl3感受态细胞或其它适当的感受态细胞,Amp抗性,进行质粒的小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。
b. 鉴定:抽提获得的质粒可使用菌落PCR的方法进行鉴定,Forward primer为5′TATACGATACAAGGCTGTTAGAGAG3′,Reverse primer为5′ACTGTGGGCGATGTGCGCTCTG3′,PCR产物约为700bp。也可进一步测序鉴定,测序引物为hU6,Forward primer为5′ATGGACTATCATATGCTTACCGTA3′。比对序列为:ATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNN
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCAC
CGAGTCGGTGCTTTTTTG。其中N为sgRNA序列。
2. 慢病毒包装与浓缩:
a. 细胞的准备:复苏用于慢病毒包装的HEK293T细胞,24小时后1:3传至10cm培养皿,37℃、5% CO2培养箱24小时。复苏后的细胞尽量能培养一周以上后再进行慢病毒的包装,效果更好。
b. 慢病毒的包装:对于10cm培养皿,在500µl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium中加入本sgRNA质粒、pMDLg、Rev、VSV-g分别为10µg、6.5µg、2.5µg、3.5µg,混匀后加入一定量转染试剂和培养液混合液,转染试剂推荐使用Lipo293™转染试剂(C0521)Lipo6000™转染试剂(C0526)Lipo8000™转染试剂(C0533)或其它合适的转染试剂,具体转染步骤参考特定转染试剂的产品说明书。转染后24小时和48小时可两次收集培养液上清,上清用0.45µm的针头滤器进行过滤,该上清含慢病毒,可直接使用。上清可分装后-80℃冻存。
c. 慢病毒的浓缩:如果需要滴度更高的慢病毒,可以使用100kDa的超滤管进行超滤浓缩,如碧云天的超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) (FUF158)或Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (UFC9100),4℃、按照推荐的最高转速离心30分钟左右,最终剩下约400µl的病毒浓缩液。病毒浓缩液可以分装后-80℃冻存。
3. 慢病毒的感染:
a. 确定puromycin的筛选浓度:待感染的细胞按一定密度铺在12孔或24孔中,按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性,推荐使用碧云天的Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度,具体步骤参考碧云天该产品的使用说明:https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm
b. 慢病毒感染细胞:按实验需要将细胞铺板(如12孔板),细胞数以第2天密度约50%为宜。设置非感染细胞组、对照组和基因敲除组。37℃培养过夜后,培养液中加入5~10μg/ml的Polybrene(C0351/ST551)。病毒感染前,从-80℃冰箱取出病毒后冰浴融化,参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值加入适量病毒,对于未浓缩的病毒,可以直接按0.5ml/孔加入细胞,对于浓缩或测定滴度的病毒,一般100µl/孔或107 TU已经足够,轻轻摇匀,37℃继续培养。两天后,吸除含病毒的培养液,换为新鲜的含一定浓度的puromycin的培养液进行筛选,一般筛选2天后,非感染细胞组细胞逐渐死去,加入病毒组存活率比较高,就可以收集部分细胞检测目的蛋白的表达或进行其它实验。培养过程中,可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后,puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml,然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞),筛选单克隆细胞株。病毒感染的方法可参考Polybrene (C0351)的使用说明:https://www.beyotime.com/product/C0351-1ml.htm
4. 直接转染细胞与稳定株的筛选
a. 选择合适的拟敲除目的基因的细胞,使用Lipo8000™转染试剂(C0533)Lipo6000™转染试剂(C0526)或其它合适的转染试剂,具体转染细胞的步骤参考特定转染试剂的产品说明。
b. 确定puromycin的筛选浓度:细胞按一定密度铺在12孔或24孔中,按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性,推荐使用碧云天的Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度,具体步骤参考碧云天该产品的使用说明:https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm
c. 转染后约48小时,按照上述检测获得的puromycin筛选浓度加入puromycin,筛选阳性细胞。一般筛选2天后,阴性细胞逐渐死去。培养过程中,可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后,puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml,然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞),筛选单克隆细胞株。
5. 基因编辑的鉴定:
a. 对于多克隆细胞,可以通过T7 Endonuclease I (T7EI)进行鉴定,即提取细胞的基因组DNA,在sgRNA序列两边设计引物进行PCR扩增,然后进行T7EI酶切,具体请参考碧云天的T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) (D7080)基因组编辑突变检测试剂盒(D0508);也可以通过相应的抗体进行检测。
b. 对于单克隆细胞,可通过PCR扩增出sgRNA靶向的基因片段后进行常规测序的方式进行验证,同时也可以使用相应的抗体进行检测。
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ST551-250mg Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) 250mg
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