碧云天的化学发光法RNA EMSA试剂盒(Chemiluminescent RNA EMSA Kit)，简称化学发光法REMSA试剂盒或Chemiluminescent REMSA Kit，是一种高效、灵敏的通过化学发光法检测生物素(Biotin)标记的RNA EMSA探针及其与蛋白质相互作用的试剂盒。

RNA结合蛋白(RNA binding proteins, RBPs)调控RNA的加工、成熟、运输、稳定性、翻译和降解，以促进细胞的生存和生长[1,2]。研究RNA和蛋白的相互作用对正常的细胞功能和调节至关重要，而这种相互作用的检测通常需要使用放射性标记的RNA探针进行放射性EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)或2D蛋白质凝胶电泳(2D protein gel electrophoresis)。EMSA是一种灵敏的技术，是基于DNA/RNA-蛋白复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理，可用于鉴定蛋白质与核酸的相互作用。该技术提供了研究DNA或RNA结合蛋白和鉴定核酸底物的有效方法[3]。在RNA EMSA实验中，末端标记的RNA探针与特定蛋白结合，形成RNA-蛋白复合物。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，RNA-蛋白复合物的迁移速度比游离的RNA探针慢，可以观察明显的位移条带，即可判断RNA和蛋白的相互作用。传统的放射性EMSA技术程序繁琐，耗时较长，需要2-3天才能获得结果。本试剂盒为基于生物素标记探针的非放射性EMSA试剂盒(Biotin-EMSA)，采用了高灵敏度的化学发光技术，利用高质量的Streptavidin-HRP Conjugate和BeyoECL Moon (一种极超敏的以luminol为基础的ECL类化学发光试剂)对生物素标记的RNA探针进行检测，轻松实现了RNA EMSA，实验时间大大缩短，约7-8个小时即可完成。

为验证整个化学发光法RNA EMSA实验条件和体系，本试剂盒提供了阳性对照系统，包含阳性蛋白、生物素标记RNA阳性探针、未标记RNA阳性探针。本试剂盒中的阳性探针与阳性蛋白能很好的结合，产生明显的位移带(Shift band)。使用本试剂盒对于阳性蛋白、HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白的RNA EMSA效果参考图1。

图1.碧云天化学发光法RNA EMSA试剂盒(GS606)对阳性蛋白、HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白的检测效果图。对于阳性蛋白及HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白，包含阴性对照反应(样品1、4、8)、蛋白样本-RNA探针的结合反应(样品2、5、9)和未标记探针冷竞争反应(样品3、6、10)；对于HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白，由于含有内源性Biotin标记的蛋白，同时设置了蛋白本身的对照(样品7、11)。对于含有内源性Biotin标记蛋白引起的条带(Endo biotin-protein band)，可以使用碧云天的生物素检测封闭试剂盒(P0101)降低内源性背景，但可能不会完全消除，若实验中目的蛋白较纯或者样品量较大，可缩短曝光时间以降低背景杂带。实际结果会因蛋白种类、纯度、电泳条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒采用了非特异性结合比Avidin更低的Streptavidin，使检测结果背景更低灵敏度更高。

本试剂盒可以用于100个蛋白和探针的结合反应和完整的10次阳性对照结合反应，并足够检测至少10块有生物素标记RNA EMSA探针的膜。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
GS606-1	REMSA Binding Buffer (10X)	120μl
GS606-2	REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)	200μl
GS606-3	REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10X)	200μl
GS606-4	BeyoECL Moon A液	55ml
GS606-5	BeyoECL Moon B液	55ml
GS606-6	Streptavidin-HRP Conjugate	100μl
GS606-7	封闭液	380ml
GS606-8	洗涤液(5X)	250ml
GS606-9	检测平衡液	250ml
GS606-10	生物素标记RNA阳性探针	30μl
GS606-11	未标记RNA阳性探针	10μl
GS606-12	阳性蛋白	20μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，至少一年有效。BeyoECL Moon A液、BeyoECL Moon B液、封闭液、洗涤液(5X)和检测平衡液可以4℃保存，至少一年有效。生物素标记RNA阳性探针和未标记RNA阳性探针最好能在-80℃保存。

注意事项：

操作过程要严格保证无RNase污染。请戴上口罩和手套操作，尽量防止人体表面的RNase污染样品。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒或耗材呼气或说话，以防RNase污染。对于操作环境中RNase的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌、仪器设备表面或其它接触面上的RNase。

所用试剂和耗材都要求是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水溶液浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。

蛋白样品制备过程中样品的稀释等都需使用BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)或DEPC水(DNase、RNase free) (R0022)。

初次实验时可使用试剂盒提供的阳性蛋白、生物素标记RNA阳性探针及未标记RNA阳性探针进行系统测试，确保实验体系正常。

需自备带正电荷尼龙膜，以及凝胶电泳时所需的相关试剂。带正电荷尼龙膜(FFN10/FFN11/FFN13/FFN15)可以向碧云天订购。

如果需要使用更多的封闭液或洗涤液，可另外单独订购封闭液(GS009B)或洗涤液(5X) (GS009W)。

BeyoECL Moon A液和B液在吸取过程中必须要更换枪头，A液和B液相互污染后会导致A液或B液逐渐失效，影响后续的使 用效果。

各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是BeyoECL Moon B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。

BeyoECL Moon A液和B液均对人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.探针的制备：
本试剂盒只提供生物素标记RNA阳性探针和未标记RNA阳性探针，不提供RNA探针生物素标记的相关试剂，如有需要，可以咨询碧云天RNA合成技术服务：https://www.beyotime.com/support/RNA synthesis.htm。
2.EMSA胶的配制：
用户可自备所需试剂，按照本步骤配制EMSA胶，也可直接购买BeyoGel™ EMSA PAGE预制胶(6%) (GS305/GS306)。
a.准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(E6011-6015/E6020-6025/E6030/E6032/E6035/E6038)。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
b.按照下表配制10ml 6%的聚丙烯酰胺凝胶。

Reagent	Volume	Cat. No. of Beyotime
TBE Buffer (5X)	1.0ml	ST718/ST723
Ultrapure water	6.6ml	ST876/R0021/R0022
29:1 Acrylamide/Bisacrylamide (30%, w/v)	2ml	ST003
80% Glycerol	312.5µl	ST1348/ST1353
10% Ammonium persulfate	75µl	ST005
TEMED	10µl	ST728
Total	10ml	-

注：按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
3.EMSA结合反应：
a.按照下表设置EMSA结合反应。阴性对照组(Negative Control)：仅含标记探针；探针冷竞争组(Cold Probe Competition Group)：含样品蛋白、标记探针、标记探针400倍量的未标记探针；无探针样品组(Sample without Probe Group)：含样品蛋白，用来排除样本蛋白是否存在自身的内源性Biotin。其中样品组(Sample Group)也可以是阳性对照相应的试剂。

Reagent	Negative Control	Sample Group	Cold Probe Competition Group	Sample without Probe Group
Ultrapure water	8µl	7µl	6µl	8µl
REMSA Binding Buffer (10X)	1µl	1µl	1µl	1µl
Protein Extract	-	1µl	1µl	1µl
Unlabeled RNA probe	-	-	1µl	-
Biotin-labeled RNA probe	1µl	1µl	1µl	-
Total	10µl	10µl	10µl	10µl

b.按照上表顺序依次加入各种试剂，在加入生物素标记好的RNA探针(Biotin-labeled RNA probe)前先混匀。混匀之后先让未标记的RNA探针(Unlabeled RNA probe)冰上先反应10分钟，以消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合。然后加入标记好的RNA探针，混匀，置于冰上反应10分钟。
注1：混匀的时候不能大幅度振荡，轻轻混匀即可，全部操作都需在冰上进行。
注2：试剂的加入顺序可能会影响RNA-蛋白复合体的特异性，请始终按照上表中列出的顺序添加结合反应组分。
注3：对于进行supershift测试的情况，添加相应的目的蛋白的抗体，相应减少超纯水的添加量即可。
c.选做：不同蛋白样品的实验结果可能存在差异，通过添加其它成分如2M KCl、50% Glycerol、1M MgCl₂、500mM DTT (ST040/ST041/ST043)和tRNA/Yeast RNA (R0040)等，可以实现对测试系统的优化。KCl、MgCl₂和DTT浓度增加可以增强结合反应，但过多的DTT会增加背景。添加Glycerol能够稳定蛋白质折叠，但过多的Glycerol会导致沿泳道边缘出现垂直条纹。tRNA/Yeast RNA是非特异性竞争性RNA，能够排除非特异性结合。测试每种试剂的效果需要分别建立反应，所涉及到的试剂可以向碧云天单独购买。
d.加入1µl REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。
注：有时候溴酚蓝会影响蛋白和RNA的结合，建议尽量使用REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)。如果对于使用REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)在上样时感觉到无法上样，可以在REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)里面添加极少量的REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10X)，至可以观察到蓝颜色即可。
4.电泳：
a.用0.5X TBE (ST718/ ST723)作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。注：预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
b.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
c.按照10V/厘米的电压电泳，电泳至REMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
注：如果温度升高，则会影响条带清晰度，为确保胶的温度不超过30℃，电泳的过程需在冰浴中进行。
5.转膜：
a.取一片和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5X TBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b.取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5X TBE浸湿。
c.把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d.非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
e.再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
f.采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5X TBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10×8×0.1cm的EMSA胶，用常用的Western转膜装置(E6150/E6155/E6159)，电转时可以设置为360mA (约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
g.转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
6.交联：
a.用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
b.交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。
c.如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连Free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤6a的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
7.化学发光法检测生物素标记的探针：
a.37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
注：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天须特别注意。
b.取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c.取6µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到6ml封闭液中(1:1000稀释)，混匀备用。
d.去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的6ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动20分钟。
e.取25ml洗涤液(5X)，加入100ml ddH2O或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f.将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g.去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢洗涤5分钟。
h.重复步骤7g三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
i.将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j.取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成10ml BeyoECL Moon工作液。
注1：BeyoECL Moon工作液必须现配现用。
注2：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
k.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l.在尼龙膜的表面小心加上步骤7J配制好的10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或化学发光成像仪检测。
m.压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片0.5、1、3、5分钟，然后一起显影定影观察结果。
n.化学发光成像仪检测：将膜放置到化学发光成像仪内，参考仪器说明书进行检测，如使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600)，自动或手动曝光。使用本试剂盒对于阳性蛋白、HeLa细胞的细胞核蛋白和细胞浆蛋白的RNA EMSA效果参考图1。
参考文献
1.Gerstberger S, Hafner M, Tuschl T. Nat Rev Genet. 2014. 15(12):829-45.
2.Marondedze C, Thomas L, Serrano NL, Lilley KS, Gehring C. Sci Rep. 2016. 6:29766.
3.Hogan DJ, Riordan DP, Gerber AP, Herschlag D, Brown PO. PLoS Biol. 2008. 6(10):e255.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
GS002	EMSA/Gel-Shift试剂盒	100次
GS008	EMSA探针生物素标记试剂盒	20次
GS009	化学发光法EMSA试剂盒	100次
GS305S	BeyoGel™ EMSA PAGE预制胶(6%, 10孔)	10块
GS306S	BeyoGel™ EMSA PAGE预制胶(6%, 15孔)	10块
GS606	化学发光法RNA EMSA试剂盒	100次
D3308	化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒	1000cm2