化学发光法EMSA阳性对照试剂盒
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产品编号 GS010S
数量
¥ 668.00
产品包装:
60次
产品简介
使用说明
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碧云天生产的化学发光法EMSA阳性对照试剂盒(Chemiluminescent EMSA Positive Control Kit),是一种提供了阳性探针、阳性蛋白和阳性蛋白抗体等专用于化学发光法进行EMSA检测时作为阳性对照的试剂盒。本试剂盒可用于检测整个化学发光法EMSA实验条件和体系是否正常。

EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)是研究蛋白和核酸相互作用的一种常用方法[1-2]。本试剂盒提供了生物素标记阳性探针、未标记阳性探针、阳性蛋白和阳性蛋白抗体,可以很方便地测试阳性蛋白与阳性探针的结合反应、探针冷竞争反应和Super-shift反应,获得比较理想的非同位素的EMSA检测的阳性对照检测结果。

本试剂盒需配套碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)进行使用。

本试剂盒可以用于共60次反应,包括阴性对照反应、阳性对照反应、未标记探针冷竞争反应和基于抗体的Super-shift反应各15次。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
GS010S-1 生物素标记阳性探针 60μl
GS010S-2 未标记阳性探针 15μl
GS010S-3 阳性蛋白 45μl
GS010S-4 阳性蛋白抗体 15μl
GS010S-5 EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X, 阳性对照专用) 120μl
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。

注意事项:

探针避免加热到40ºC以上,温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。

阳性蛋白和生物素标记阳性探针反应时需要使用经过优化的EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X, 阳性对照专用),不能使用其它EMSA试剂盒中的EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)。

需自备带正电荷尼龙膜,以及凝胶电泳时所需的相关试剂。带正电荷尼龙膜(FFN10/FFN11/FFN13/FFN15)可以向碧云天订购。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.EMSA胶的配制:
a.准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如碧云天或BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置),或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净,需特别注意不能有SDS残留。
b.按照如下配方配制20ml 4%的聚丙烯酰胺凝胶(注:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
Reagent Volume
TBE Buffer (10X) 1.0ml
重蒸水 16.2ml
39:1 Acrylamide/Bisacrylamide (40%, w/v) 2ml
80%甘油 625µl
10%过硫酸铵(Ammonium persulfate) 150µl
TEMED 10µl
c.按照上述顺序依次加入各种试剂,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡,并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
2.EMSA结合反应:
a.如下设置EMSA结合反应:
阴性对照反应
Nuclease-Free Water 7µl
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X, 阳性对照专用) 2µl
阳性蛋白 0µl
生物素标记阳性探针 1µl
总体积 10µl
阳性对照反应
Nuclease-Free Water 6µl
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X, 阳性对照专用) 2µl
阳性蛋白 1µl
生物素标记阳性探针 1µl
总体积   10µl
探针冷竞争反应
Nuclease-Free Water 5µl
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X, 阳性对照专用) 2µl
阳性蛋白 1µl
未标记阳性探针 1µl
生物素标记阳性探针 1µl
总体积 10µl
Super-shift反应
Nuclease-Free Water 5µl
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X, 阳性对照专用) 2µl
阳性蛋白 1µl
阳性蛋白抗体 1µl
生物素标记阳性探针 1µl
总体积 10µl
b.按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25ºC)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25ºC)放置20分钟。
c.加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。
注1:从本步骤起,需配套碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)进行使用。
注2:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至可以观察到蓝颜色即可。
3.电泳:
a.用0.5X TBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。
b.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色),用于观察电泳进行的情况。
c.按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30ºC,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。
4.转膜:
a.取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜,剪角做好标记,用0.5X TBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取,并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b.取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸,用0.5X TBE浸湿。
c.把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上,注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d.非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上,注意确保胶和膜之间没有气泡。
e.再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上,注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
f.采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置,以0.5X TBE为转膜液,把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10×8×0.1cm的EMSA胶,用碧云天或BioRad的常用的Western转膜装置,电转时可以设置为380mA (约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚,则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低,通常可以把电转槽置于4ºC冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转,这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
g.转膜完毕后,小心取出尼龙膜,样品面向上,放置在一干燥的滤纸上,轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤,不可使膜干掉。
5.交联:
a.用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长,120mJ/cm2,交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002)),距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯,距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
b.交联完毕后,可以直接进入下一步检测;也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天,然后再进入下一步检测。
c.如果检测结果发现交联效果不佳,甚至连free probe的条带都非常微弱,可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次,以进一步改善交联效果。
6.化学发光法检测生物素标记的探针:
a.37-50ºC水浴溶解封闭液和洗涤液。
注意:封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用,封闭液和洗涤液可以在室温至50ºC之间使用,但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生,在冬天需特别注意。
b.取一合适的容器加入15ml封闭液,再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c.取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释),混匀备用。
d.去除用于尼龙膜封闭的封闭液,加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e.取25ml洗涤液(5X),加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水,混匀配制成125ml洗涤液。
f.将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内,漂洗1分钟。
g.去除洗涤液,加入15-20ml洗涤液,在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h.重复步骤G 三次(共洗涤四次),每次洗涤时间都约为5分钟。
i.将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内,在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j.取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀,配制成BeyoECL Moon工作液。注:BeyoECL Moon工作液必须现配现用。说明:从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的萤光检测。
k.取出尼龙膜,用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上,放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l.在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液,使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。取出尼龙膜,用吸水纸吸去过多液体。将膜放在两片保鲜膜中间,随后进行压片检测或化学发光成像仪检测。
m.压片检测:将膜固定于片夹内。暗室内压片1分钟,立即显影定影,根据结果再调整压片时间。或直接分别压片30秒、1、3、5分钟,然后一起显影定影观察结果。
n.化学发光成像仪检测:将膜放置到化学发光成像仪内,参考仪器说明书进行检测,如使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600),自动或手动曝光。使用本试剂盒得到的阳性蛋白-探针的结合反应、探针冷竞争反应和Super-shift反应结果参见图1。
图1.碧云天化学发光法EMSA阳性对照试剂盒检测结果。1为阴性对照反应;2为阳性蛋白-探针的结合反应;3为未标记探针冷竞争反应;4为阳性蛋白抗体的Super-shift反应。实际结果会因蛋白种类、电泳条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。
参考文献:
1.Revzin A. Biotechniques. 1989. 7(4):346-55.
2.Laniel MA, Béliveau A, Guérin SL. Methods Mol Biol. 2001.148:13-30.
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