pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla
收藏
产品编号 D8308-100μg
数量
¥ 1169.00
产品包装:
1μg 100μg
产品简介
使用说明
说明书下载
相关产品
相关论文
产品问答

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla是碧云天自行研发的用于方便地插入靶向目的基因的sgRNA (Single guide RNA)并使用CRISPR/Cas9基因编辑(Gene editing)系统进行基因编辑的质粒。本质粒能同时表达mCherry便于观察转染效率或感染效果,同时携带了Bla抗性,方便后续进行多克隆或单克隆稳定细胞株的筛选。本质粒在插入靶向目的基因的sgRNA后,可以直接转染细胞进行基因编辑,也可以用于包装慢病毒后感染细胞或组织进行基因编辑。

慢病毒(Lentivirus)是以HIV-1 (人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效地将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达,被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中[1-3]。本慢病毒载体进行了多方面的改造,删除了慢病毒绝大部分的致病基因,并使包装后的病毒失去了自我复制能力,安全性大大提升,并能有效提高外源基因的表达效果。本质粒可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。

本质粒经过BsmBⅠ (CGTCTC(1/5)^)限制性核酸内切酶消化后,切除图谱中标示的filler,把设计好的靶向特定基因的sgRNA序列经退火后形成的双链寡核苷酸片段连接到载体中,就能构建成相应的用于基因编辑的质粒了。

本质粒中使用了人源化脓性链球菌Cas9 (Humanized S. pyogenes Cas9, hSpCas9)。hSpCas9是一种能在sgRNA的引导下切割双链DNA的核酸内切酶。在sgRNA的引导下,Cas9剪切基因靶位点产生双链DNA断裂,随后在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换,从而可能产生移码突变,导致目的基因的缺失突变。当设计的sgRNA的基因靶位点相对比较靠近5'端的时候,就能导致通常所说的基因敲除。本质粒中在hSpCas9的C端添加了核定位信号(Nuclear localization signal, NLS),能够有效确保hSpCas9定位在细胞核,从而有效提高基因编辑效率。

本质粒表达的Cas9带有Flag标签,可通过Flag抗体(AF0036/AF5051/AF519)检测Cas9的表达。同时本质粒中Cas9-Flag和mCherry之间通过P2A连接。mCherry与Cas9-Flag同时翻译,可以呈现很强的红色荧光,可以在荧光显微镜下非常便捷地观察到本质粒的表达情况(图1),并且也方便使用流式细胞仪分选阳性细胞。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切,而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用,最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas-Flag的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG),而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列,可提高剪切效率。

图1.碧云天pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片,右侧为荧光照片。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和杀稻瘟菌素S (Blasticidin S)抗性。在大肠杆菌中呈现氨苄青霉素抗性。本质粒转染哺乳动物细胞后,可使用Blasticidin S HCl (灭瘟素S) (ST018)筛选多克隆或单克隆细胞株。

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 1-199
5' LTR (truncated) 217-397
HIV-1 Ψ 444-569
RRE 1062-1295
cPPT/CTS 1822-1939
U6 promoter 1990-2230
filler 2235-4119
gRNA scaffold 4120-4195
EF-1α core promoter 4257-4468
Kozak sequence 4487-4496
Cas9 4493-8596
nucleoplasmin NLS 8597-8644
FLAG 8645-8668
P2A 8678-8734
mCherry 8735-9445
WPRE 9461-10049
Factor Xa site 9932-9943
3' LTR (ΔU3) 10121-10354
bGH poly(A) signal 10386-10610
f1 ori 10656-11084
SV40 promoter 11098-11427
SV40 ori 11278-11413
EM7 promoter 11475-11522
BSD 11541-11939
SV40 poly(A) signal 12069-12190
M13 rev 12239-12255
lac operator 12263-12279
lac promoter 12287-12317
CAP binding site 12332-12353
ori 12641-13229
AmpR 13400-14260
AmpR promoter 14261-14365
CMV enhancer 14631-15010

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla质粒(15011bp)的图谱如下:

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8308 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla.pdf

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AscI AsiSI AspI AxyI BoxI
Bse21I BsiWI BstHPI BstPAI Bsu36I CpoI CspI
Eco81I FseI FspAI HpaI I-CeuI I-PpoI I-SceI
KspAI MauBI MreI PaeR7I PalAI Pfl23II PflFI
PI-PspI PI-SceI PshAI PspLI PspXI PsyI RgaI
RigI RsrII Rsr2I SfaAI SfiI Sfr274I SgfI
SgsI SlaI SrfI Tth111I XhoI

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla中的单酶切位点包括:

Acc65I G`GTAC,C 1984 NotI GC`GGCC,GC 907
AfeI AGC|GCT 4483 PacI TTA,AT`TAA 1980
AgeI A`CCGG,T 4470 PasI CC`CWG,GG 6262
AvrII C`CTAG,G 11412 PmeI GTTT|AAAC 10364
BamHI G`GATC,C 8669 SacII CC,GC`GG 9964
BmtI G,CTAG`C 4212 SbfI CC,TGCA`GG 9090
BspDI AT`CG,AT 3277 SexAI A`CCWGG,T 11179
BsrGI T`GTAC,A 9444 SgrAI CR`CCGG,YG 9416
BssHII G`CGCG,C 474 SgrDI CG`TCGA,CG 14394
BstBI TT`CG,AA 2849 SmaI CCC|GGG 11435
BstZ17I GTA|TAC 12201 SnaBI TAC|GTA 14986
ClaI AT`CG,AT 3277 SpeI A`CTAG,T 14645
EcoRI G`AATT,C 4202 SwaI ATTT|AAAT 3632
EcoRV GAT|ATC 6346 TspMI C`CCGG,G 11433
FspI TGC|GCA 13695 XbaI T`CTAG,A 4476
KpnI G,GTAC`C 1988 XmaI C`CCGG,G 11433
NheI G`CTAG,C 4208

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla质粒可使用的测序引物序列如下:

sgRNA的测序引物hU6-F primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'

pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla的全序列信息:D8308 pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8308-1μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla 1μg
D8308-100μg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.本质粒构建方案如下,仅供参考。
a.质粒酶切和去磷酸化。
Reagent Volume
pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Bla xμl (1-2μg)
FastDigest BsmBI 1μl
BeyoAP Alkaline Phosphatase (D7027) 1μl
10X FastDigest Buffer 2μl
100mM DTT 0.2μl
ddH2O (15.8-x)μl
Total volume 20μl
Incubate at 37℃ for 30min
b.使用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切后的质粒。
如果质粒成功被BsmBI酶切,则会产生两个片段,一个大的为目的片段,小片段为filler。酶切电泳鉴定后,切胶胶回收12kb的目的条带,弃去约2kb的filler条带。
c.磷酸化和退火Oligos。
Reagent Volume
sgRNA oligo 1 (100μM) 1μl
sgRNA oligo 2 (100μM) 1μl
10X T4 Ligation Buffer 1μl
ddH2O 6.5μl
T4 Polynucleotide Kinase (D7096) 0.5μl
Total volume 10μl
设计Oligo的原则如下:
Forward: 5'-CACCG-20bp-3'
Reverse: 5'-AAAC-20bp (Copy bottom strand 5'->3')-C-3'
注1:反应中请使用T4 Ligation Buffer,因为随T4 Polynucleotide Kinase (D7096)提供的缓冲液不包含ATP。如果使用随T4 Polynucleotide Kinase (D7096)提供的缓冲液,请补充1mM ATP。
注2:使用以下参数将磷酸化/退火反应放入热循环仪中:37℃ 30min,95℃ 5min,然后以5℃/min的速度下降到25℃。
d.将步骤3c中退火的双链寡核苷酸以1:200的比例稀释到超纯水中。
e.按照常规连接方式进行连接反应。
取50ng步骤3b中经BsmBI酶切且纯化后的质粒,与1μl步骤3d中稀释后的双链寡核苷酸进行连接,具体连接用量与步骤参照所使用的连接试剂盒说明书进行。推荐使用碧云天生产的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)进行连接反应。建议同时设置阴性对照(仅含有载体,用水代替退火的双链寡核苷酸)。
f.转化至Stbl3菌。
本质粒包含长末端重复序列(LTR),适合转化至重组缺陷菌,使用Stbl3甘油菌(D0378)能够获得良好的质粒产量。尽管其它RecA菌株可能有效,但我们测试发现使用Stbl3的转化效率和质粒产量都总体更加理想。
g.直接转染细胞或进行慢病毒的包装。
推荐使用碧云天生产的Lipo8000™转染试剂(C0533)转染细胞。构建好的质粒后续也可以和pCMV-VSV-G (D8215)以及pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。
参考文献:
1.Mautino MR. Curr Gene Ther. 2002. 2(1):23-43.
2.Sumimoto H, Kawakami Y. Future Oncol. 2007. 3(6):655-664.
3.Stripecke R, Koya RC, Ta HQ, Kasahara N, Levine AM. Blood Cells Mol Dis. 2003. 31(1):28-37.
相关产品:
产品编号 产品名称 包装
D8301-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo 1μg
D8301-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Neo 100µg
D8302-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Neo 1μg
D8302-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Neo 100µg
D8303-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Puro&Zeocin 1μg
D8303-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Puro&Zeocin 100µg
D8304-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Puro&Zeocin 1μg
D8304-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Puro&Zeocin 100µg
D8305-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin 1μg
D8305-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Zeocin 100µg
D8306-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Zeocin 1μg
D8306-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Zeocin 100µg
D8307-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Bla 1μg
D8307-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Bla 100µg
D8309-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro 1μg
D8309-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-EGFP-Hygro 100µg
D8310-1µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro 1μg
D8310-100µg pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro 100µg
ST018-10mg Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg
ST018-1ml Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg/ml×1ml
ST018-50mg Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 50mg
ST018-5ml Blasticidin S HCl (灭瘟素S) 10mg/ml×5ml
ST007 Ampicillin 5g
ST008 Ampicillin (100mg/ml, 1000X) 5ml
D8215-1μg pCMV-VSV-G (慢病毒包装用质粒) 1μg
D8215-100μg pCMV-VSV-G (慢病毒包装用质粒) 100μg
D8216-1μg pCAG-dR8.9 (慢病毒包装用质粒) 1μg
D8216-100μg pCAG-dR8.9 (慢病毒包装用质粒) 100μg
D8202-1μg pLenti-H1 (慢病毒小RNA表达载体, 绿色荧光) 1μg
D8202-100μg pLenti-H1 (慢病毒小RNA表达载体, 绿色荧光) 100μg
AF5051 Flag Tag Mouse Monoclonal Antibody 50μl
AF0036 FLAG Tag Rabbit Polyclonal Antibody 100μl
AF519 Flag抗体(小鼠单抗) >40次
AF0123 CRISPR-Cas9 Mouse Monoclonal Antibody 50μl
D7096 T4 Polynucleotide Kinase 100U
D7097 T4 Polynucleotide Kinase 500U
D7002 快速DNA连接试剂盒 100次
D7003 快速DNA连接试剂盒 500次
D7006 T4 DNA Ligase 40,000U
D7008 T4 DNA Ligase 200,000U
D7027 BeyoAP Alkaline Phosphatase 200U
D0378 Stbl3甘油菌 200μl
C0533-0.5ml Lipo8000™转染试剂 0.5ml
C0533-1.5ml Lipo8000™转染试剂 1.5ml
C0533-7.5ml Lipo8000™转染试剂 5×1.5ml
相关产品请点击如下按钮:
使用本产品的文献: