pLenti-H1(慢病毒小RNA表达载体, 绿色荧光)
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产品编号 D8202-100μg
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1μg 100μg
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pLenti-H1是一种碧云天自行研发的使用特别便捷的用于表达小RNA并同时表达绿色荧光蛋白GFP的重组慢病毒载体。该载体可以用于表达siRNA (small interference RNA),也称RNAi (RNA interference),或用于表达microRNA等其它小RNA。一方面,该载体可用于和pCMV-VSVG质粒(D8215)及pCAG-dR8.9(delta8.9,Δ8.9)(D8216)共同转染HEK-293T细胞以包装慢病毒;另一方面,也可单独用于直接转染细胞,用于表达siRNA、miRNA等小RNA。

pLenti-H1含有H1启动子,适合驱动小RNA的表达。同时pLenti-H1含有CMV启动子驱动表达的绿色荧光蛋白基因GFP。直接转染哺乳动物细胞后或者包装好的病毒感染哺乳动物细胞后,CMV启动子能高效启动绿色荧光蛋白GFP的表达,可以方便地通过观察绿色荧光来确定转染或感染效率,从而来推测目的小RNA的表达情况。

慢病毒(Lentivirus)是以 HIV-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的病毒载体系统。它能高效的将目的基因(蛋白质编码序列或小RNA)导入动物或人的原代细胞或细胞系。慢病毒的宿主范围广,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中。pLenti-H1作为慢病毒载体删除了病毒绝大部分的致病基因,保留了包装、逆转录和整合所需的 HIV-1顺式作用序列长末端重复序列(LTR),并对HIV的5’LTR进行改造,换成CMV启动子,同时对3’LTR进行了缺失突变,使病毒载体失去了自我复制能力,安全性大大提升。pLenti-H1中还加入了WRE元件,能够显著提高外源基因的表达。

pLenti-H1使用特别便捷,本载体通常仅须酶切1小时,无须酶切过夜,即可切胶回用于质粒构建。本载体由于BamH I和Xho I酶切位点之间预插入了一段长1008 bp的片段,从而可以通过电泳来区分单酶切和双酶切的片段,所以pLenti-H1用BamH I和Xho I通常双酶切1小时即可电泳切胶回收目的片段用于后续的连接反应,无需酶切过夜,这样可以显著缩短构建质粒所需的时间。目的小RNA的DNA序列合成并退火后可以直接连接入在BamH I和Xho I酶切位点之间。构建好的能表达目的小RNA的pLenti-H1质粒与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G(VSVG)(D8215)和pCAG-dR8.9(也称为delta8.9或Δ8.9)(D8216)共同转染到HEK-293T细胞中完成慢病毒的包装,就可以制备获得高滴度、自我复制缺陷并且能表达小RNA的重组慢病毒。

pLenti-H1为氨苄青霉素抗性。

pLenti-H1质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
CMV promoter 254-817
5’LTR 818-1016
Psi 1066-1203
FLA P 2447-2570
H1 promoter 2662-2759
Inserted DNA fragment 2766-3774
Lox P 3835-3868
CMV 3918-4520
GFP 4536-5254
Lox P 5275-5308
WRE 5364-5952
3’SIN-LTR 6160-6662
pUC 6664-7337
Ampr 7482-8342

pLenti-H1质粒(8475bp)的图谱如下:

pLenti-H1插入片段附近的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8202 pLenti-H1(慢病毒小RNA表达载体,绿色荧光).pdf

pLenti-H1中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pLenti-H1)包括:

AscI AvrII BsiCI BsiWI BsmBI Bst1107I BstBI
BstEII BstXI Eco72I HpaI PmeI PmlI PspAI
RsrII SfiI SmaI SphI SplI SrfI StuI
Tth111I XcaI XcmI XmaI

pLenti-H1中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pLenti-H1 once)包括:

MluI A`CGCG,T 232 BlpI GC`TNA,GC 3727
SpeI A`CTAG,T 253 EspI GC`TNA,GC 3727
BssHII G`CGCG,C 1093 MscI TGG|CCA 3754
SapI GCTCTTC 8/11 1484 PaeR7I C`TCGA,G 3776
FseI GG,CCGG`CC 1532 XhoI C`TCGA,G 3776
EcoNI CCTNN`N,NNAGG 1554 BspMI ACCTGC 10/14 3810
BsmI GAATG,C 7 1978 NotI GC`GGCC,GC 3891
PstI C,TGCA`G 2421 NsiI A,TGCA`T 3923
XbaI T`CTAG,A 2617 NheI G`CTAG,C 4515
BamHI G`GATC,C 2761 AgeI A`CCGG,T 4524
BsaBI GATNN|NNATC 3220 PflMI CCAN,NNN`NTGG 5606
BclI T`GATC,A 3353 SacII CC,GC`GG 5868
Bsu36I CC`TNA,GG 6087 BspMII T`CCGG,A 6469
Acc65I G`GTAC,C 6091 DrdI GACNN,NN`NNGTC 6771
Asp718 G`GTAC,C 6091 AhdI GACNN,N`NNGTC 7556
KpnI G,GTAC`C 6095 SspI AAT|ATT 8360

pLenti-H1质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

H1 primer (2678–2697): 5´TCGCTATGTGTTCTGGGAAA 3´

pLenti-H1的全序列信息:pLenti-H1序列信息.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8202-1µg pLenti-H1 1µg
D8202-100µg pLenti-H1 100µg
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定
2.pLenti-H1质粒经过BamH I和Xho I酶切后插入目的小RNA(siRNA或者microRNA)构建成为携带小RNA的慢病毒质粒,然后与慢病毒包膜质粒VSV-G(VSVG)(D8215)及包装质粒dR8.9(也称为delta8.9或Δ8.9)(D8216)共同转染到HEK-293T细胞中完成慢病毒的包装。
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