pShuttle-CMV-N-EGFP(腺病毒质粒, 绿色荧光)
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产品编号 D8129-100μg
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¥ 1169.00
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1μg 100μg
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pShuttle-CMV-N-EFGP (腺病毒质粒, 绿色荧光)是碧云天自行研发的用于构建表达N端EGFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白的重组腺病毒包装用的穿梭质粒。本穿梭质粒构建后,需要和预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)以及重组腺病毒包装细胞配合使用才能完成重组腺病毒的包装。

pShuttle-CMV-N-EFGP质粒可以用于在包装成腺病毒后表达N端含EGFP(Enhanced GreenFluorescent Protein, 增强绿色荧光蛋白)标签的融合蛋白。该质粒含有CMV启动子,可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达。在多克隆位点的前面有一个EGFP的完整编码序列,因此在多克隆位点根据阅读框插入目的基因就可以表达N端含有EGFP标签的融合蛋白。利用EGFP的荧光特性可以比较容易地观察融合蛋白的表达水平和细胞内定位,也可以利用GFP抗体来检测或免疫沉淀融合蛋白。

本质粒为卡那霉素抗性。

重组腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一种常见的用于在培养细胞或动物体内表达外源基因的重要工具。重组腺病毒具有感染宿主细胞范围广、感染不依赖细胞分裂、高滴度及目的基因表达水平高等特性。最常用的腺病毒载体是人类血清5型腺病毒。改造后的人类血清5型腺病毒,删除了在病毒装配过程中起关键作用的E1基因和非必须的能表达逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的删除使得重组腺病毒不能自我复制,同时给外源基因的插入提供了空间,最长可插入7.5kb的外源基因。从而提高了重组腺病毒的的安全性和可操作性。重组腺病毒的包装细胞,例如AD-293、293A、HEK293等细胞中,表达E1基因,这样就可以在这些包装细胞中正常装配重组腺病毒了。

pShuttle系列的穿梭质粒携带外源目的基因,经过Pme I线性化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转染到大肠杆菌BJ5183中,或者转染到已经已经预转染了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重组。BJ5183菌株表达recET基因,具有很高的基因同源重组(homologous recombination)活性,使带有目的基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1通过末端反向重复序列同源重组,实现外源基因与腺病毒基因组的整合。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备获得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。

目的基因引入时不能含有Pme I及Pac I这两个酶切位点,如果含有该两个酶切位点的目的基因,需要对该位点进行突变方可进行基因操作。

pShuttle-CMV-N-EGFP 主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
left inverted terminal repeat 1–103
encapsidation signal (ES) 183–331
CMV promoter 341–933
EGFP tag 947-1668
multiple cloning site 1670–1718
SV40 polyA 1730–1941
Ad5 right arm homology 1946–4201
Ad5 left arm homology 4248–5131
right inverted terminal repeat 5132–5234
pBR322 origin 5442–6109
kanamycin resistance ORF 6918–7709

pShuttle-CMV-N-EGFP 质粒(8195bp)的图谱如下:

pShuttle-CMV-N-EGFP质粒的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D8129 pShuttle-CMV-N-EGFP.pdf

pShuttle-CMV-N-EGFP 中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-N-EGFP)包括:

Acc65 I Afl II Age I Asc I Asp718
Blp I BsiC I BsiW I BstB I Bsu36 I
Cla I Eco72 I EcoN I Esp I Fse I
Kpn I Nru I Pml I Pvu I Sfi I

pShuttle-CMV-N-EGFP 中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-N-EGFP once)包括:

SnaBI TAC|GTA 679 PflMI CCAN,NNN`NTGG 2618
NheI G`CTAG,C 940 BstXI CCAN,NNNN`NTGG 3057
NotI GC`GGCC,GC 945 BbsI GAAGAC 8/12 3859
BamHI G`GATC,C 1670 BbvII GAAGAC 7/11 3860
HindIII A`AGCT,T 1676 Bst1107I GTA|TAC 4213
EcoRV GAT|ATC 1684 XcaI GTA|TAC 4213
SalI G`TCGA,C 1688 PmeI CTTT|AAAC 4234
MluI A`CGCG,T 1694 EcoRI G`AATT,C 4239
BglII A`GATC,T 1700 AvrII C`CTAG,G 4781
PaeR7I C`TCGA,G 1706 BspHI T`CATG,A 6177
XhoI C`TCGA,G 1706 Psp1406I AA`CG,TT 6576
XbaI T`CTAG,A 1712 RsrII CG`GWC,CG 7582
SpeI A`CTAG,T 1718 DraIII CAC,NNN`GTG 7929
ScaI AGT|ACT 1723 XmnI GAANN|NNTTC 8183
HpaI GTT|AAC 1840

pShuttle-CMV-N-EGFP 质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´

Reverse primer (1732-1754): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´

pShuttle-CMV-N-EGFP的全序列信息:pShuttle-CMV-N-EGFP序列.txt

腺病毒包装的具体方法和步骤可以参考如下网页:

https://www.beyotime.com/support/pShuttle.htm

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D8129-1µg pShuttle-CMV-N-EGFP 1μg
D8129-100µg pShuttle-CMV-N-EGFP 100μg
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.pShuttle-CMV-N-EGFP质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,插入目的基因时注意与EGFP不能发生移码突变。携带目的基因的质粒经过Pme I线性化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(D8106)共转化到大肠杆菌BJ5183中,或者转化到已经已经预转了pAdEasy-1质粒的BJ5183菌株(D8107)中进行同源重组。将重组的携带外源基因的腺病毒质粒用Pac I线性化后转染到AD-293、293A、HEK293等重组腺病毒包装细胞中进行包装。从而制备得高滴度、自我复制缺陷并且带有目的基因的重组腺病毒。
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