猫细小病毒(FPV)探针法qPCR检测试剂盒
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产品编号 D7583M
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¥ 2559.00
产品包装:
50次 200次
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碧云天生产的猫细小病毒(FPV)探针法qPCR检测试剂盒,即Feline Panleukopenia Virus (FPV) Probe qPCR Kit,也称猫细小病毒(猫泛白细胞减少症、猫瘟)探针法qPCR试剂盒、Feline Parvovirus (FPV) Probe qPCR Kit,是一种通过探针法qPCR (Quantitative PCR)快速、有效、高灵敏地检测猫是否感染细小病毒的试剂盒。本产品为防污染型,含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP,可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

猫细小病毒(Feline panleukopenia virus or parvovirus, FPV),又称猫瘟热病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒,是一种单链DNA病毒,属于细小病毒科细小病毒属。在电子显微镜下,FPV呈圆形或六角形,无囊结构[1]。基因组长度约为5200nt,包含两个开放阅读框(Open reading frame, ORF),分别编码结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NS1和NS2)。受FPV感染的动物白细胞急剧下降,同时伴有严重的发热、呕吐、腹泻等症状。病毒主要侵害幼猫,几乎所有猫科动物易感,死亡率较高,可通过患病动物的粪便、尿液和呕吐物迅速传播,在可妊娠期间垂直传播,导致胎儿小脑发育不全。因此,早期和快速诊断FPV是非常必要的,以便分离受感染的猫并实施针对性治疗,降低发病率和死亡率。

FPV感染的主要症状为发热、呕吐、腹泻,在临床上极易与其它胃肠道疾病混淆,因此仅依靠临床表现来诊断是否感染FPV较为困难。到目前为止,临床诊断FPV感染的方法有电子显微镜(Electron microscope, EM)、病毒分离(Virus isolation, VI)、乳胶凝集(Latex agglutination test, LAT)、血球凝集(Hemagglutination, HA)、ELISA和PCR分析等[2]。虽然电子显微镜和病毒分离较为特异和敏感,但这些技术在临床使用过程中昂贵且耗时。乳胶凝集法虽然检测速度快,但缺乏特异性。对于血球凝集或血清凝集抑制实验,由于FPV血凝活性弱且该方法对操作条件要求较高,相关实验条件较为苛刻,在临床检测中也易出现假阴性结果。此外,虽然ELISA和PCR因其高灵敏度和特异性被广泛使用,但操作略显复杂。而qPCR法操作方便简单,PCR扩增后无需电泳分析即可确定是否感染FPV。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的预混液BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)和特异性引物探针混合物。预混液包含了BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、稳定剂和镁离子等所有的通用组分;引物探针混合物以FPV VP2基因最保守的序列作为靶点所设计,二者结合可用于FPV DNA的超高灵敏度定量检测。此外,本试剂盒提供Positive Control,即阳性对照,用于检测试剂盒本身是否能正常工作。

本试剂盒进行了优化,检测下限为2-20 copies/µl。本试剂盒用于阳性质粒检测的平均Ct值见下表,检测效果参考图1。

Target 10pg 1pg 100fg 10fg 1fg 0.1fg NTC
平均Ct值 18.0 21.7 25.4 29.2 33.0 36.2 Undetermined

图1.碧云天猫细小病毒(FPV)探针法qPCR检测试剂盒(D7583)用于阳性质粒的检测效果图。将本试剂盒中的Positive Control稀释至每反应中的质粒量分别为10pg、1pg、100fg、10fg、1fg和0.1fg,然后用本试剂盒进行qPCR检测。使用Nuclease-free water作为阴性对照。NTC, negative control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒提供了Low ROX和High ROX,广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动,从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起,如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同,请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

添加ROX类型 适用PCR仪
不需添加 Bio-Rad: CFX384, CFX96, MiniOpticon, iCycler IQ, MyiQ and iQ5;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex and realplex2 s;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 6000;
Roche LightCycler 480; Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR
Low ROX ABI: 7500(Fast), ViiA 7, QuantStudio 6 and 7 Flex Systems;
Stratagene: Mx3000P, Mx3005P and Mx4000;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 3000;
Bio-Rad/MJ: Chromo4, Opticon 2 and Opticon
High ROX ABI GeneAmp 5700; ABI PRISM 7000, 7700; ABI 7300, 7900HT(Fast); ABI StepOne (Plus)

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl),本产品小包装分别可以进行50次和100次检测,中包装分别可进行200次和400次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7583S-1 BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X) 500μl
D7583S-2 Primer/Probe Mix 100μl
D7583S-3 Positive Control 100μl
D7583S-4 Low ROX (50X) 20μl
D7583S-5 High ROX (50X) 20μl
D7583S-6 Nuclease-free Water 500μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7583M-1 BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X) 2ml
D7583M-2 Primer/Probe Mix 400μl
D7583M-3 Positive Control 400μl
D7583M-4 Low ROX (50X) 80μl
D7583M-5 High ROX (50X) 80μl
D7583M-6 Nuclease-free Water 2ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。其中BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)、Primer/Probe Mix、Low ROX (50X)、High ROX (50X)须-20ºC避光保存,并尽量避免反复冻融。

注意事项:

使用前需确保试剂完全融化,上下颠倒轻轻混匀后使用。混匀过程中尽量避免产生气泡。

Primer/Probe Mix、Low ROX (50X)、High ROX (50X)中含有荧光染料,保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射,以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试,本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响,但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测,请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本产品为防污染型,但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖,PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理,以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系,这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.需要用户自备的耗材、仪器和试剂:
a.具有FAM荧光通道的荧光定量PCR仪。
b.DNase-free、RNase-free的吸头、离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
2.样本准备:
本试剂盒可用于检测感染猫细小病毒的血液、口鼻拭子、肛拭子等样品,用病毒DNA提取试剂盒提取后再进行PCR,推荐使用BeyoMag™磁珠法病毒RNA/DNA抽提试剂盒(R0083)。如果急需检测,也可以尝试取0.5-2μl液体样品,未经DNA提取直接作为模板尝试用于qPCR检测,但直接检测的灵敏度会有所下降。
3.qPCR反应体系的设置:
a.融解并混匀反应所需的各种溶液,置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板,每孔反应体系为20µl为例)。下表中的Template为样品、阴性对照(Negative Control)或阳性对照(Positive Control)。Negative Control可使用Nuclease-free Water。建议每次检测都设置Negative Control和Positive Control。
Reagent Volume
BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X) 10μl
Primer/Probe Mix 2μl
Template 2μl
Without or Low/High ROX (50X) 0 or 0.4μl
Nuclease-free Water To 20μl
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上,开始PCR反应。
e.荧光检测通道的选择:猫细小病毒探针的荧光基团是FAM,可选择检测通道为FAM,淬灭基团是BHQ1,如果没有BHQ1,则选择无。
4.qPCR反应程序:
本试剂盒建议采用如下的qPCR程序,本程序是以QuantStudio™ 6 Flex Systems荧光定量PCR仪为例:
a.UDG酶处理:50ºC 5min
b.预变性:95ºC 2min
c.变性:95ºC 15sec
d.退火/延伸:60ºC 15sec
e.重复步骤c和步骤d,总共40个循环
f.最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果
5.结果的定性判断:
a.阳性对照:FAM通道呈典型S型扩增曲线且Ct值≤38。
b.阴性对照:FAM通道无典型S型扩增曲线或Ct值>38。
c.样品阳性:如果待测样本检测结果呈典型S型扩增曲线且Ct值≤38,且阳性对照品检测结果为阳性,阴性对照品检测结果为阴性,此次结果判断为猫细小病毒阳性。
d.样品阴性:如果待测样本检测结果无典型S型扩增曲线或Ct值>38,且阳性对照品检测结果为阳性,阴性对照品检测结果为阴性,此次结果判断为猫细小病毒阴性。
参考文献:
1.Wang Y, Pan Y, Wu J, Tong X, Sun J, et al. 3 Biotech. 2021. 11(9):400.
2.Wang ZH, Wang XJ, Hou SH. J Virol Methods. 2019. 271:113679.
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