BeyoRT™ Q cDNA第一链合成试剂盒
收藏
产品编号 D7190M
数量
¥ 309.00
产品包装:
20次 100次 500次
产品简介
使用说明
相关文件下载
相关产品
相关论文
产品问答

碧云天生产的BeyoRT™ Q cDNA第一链合成试剂盒,即BeyoRT™ Q First Strand cDNA Synthesis Kit,是一种采用了经过改造和优化特别适合定量PCR(quantitative PCR, qPCR)的高精确度的BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶,可以用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。

使用本试剂盒合成的第一链,可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建,尤其是逆转录所得目的基因的克隆等。

本试剂盒中使用的BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶是最常用的优质反转录酶之一,广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成,特别适合用于qPCR和一步法的qRT-PCR,本产品的反转录产物也适合用于常规的PCR、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建,以及逆转录所得目的基因的克隆等。使用BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录,之后以不同稀释倍数的cDNA为模板,通过qPCR检测目的基因的结果请参考图1。

图1.BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录后用于qPCR检测的效果图。从HEK293T细胞抽提获得的总RNA 2µg,在20μl反转录体系中进行反转录,反转录后取1μl (100%)或不同稀释比例(1μl的10%、1%、0.1%、0.01%)反转录产物进行GAPDH cDNA 151bp目的片段的qPCR扩增和电泳检测。A. 扩增曲线图。B. 溶解曲线图。C. qPCR扩增产物的电泳图。NTC (no-template control),用水代替反转录产物。qPCR反应体系20µl,使用碧云天生产的D7260 BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X)。实际检测效果会和特定实验条件有关,图中结果仅供参考。

使用本试剂盒也可以轻松完成长度为8 kb以下基因的反转录(参考图2),反转录的最大长度可以达到12 kb。

图2.使用本试剂盒对总RNA反转录后,对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2-12kb的cDNA可以非常高效地被反转录。实际反转录特定目的基因片段后,PCR扩增较大片段时可能需要适当优化引物和PCR扩增条件,图中的扩增效果仅供参考。

本试剂盒提供了RNase Inhibitor,确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得良好的反转录效果。

本试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物,前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录,后者适合用于任何RNA的反转录。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。

失活或抑制:80℃孵育10min可以导致本产品中的BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶有抑制作用。

用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时,不同包装的本试剂盒足够分别进行20个、100个和500个cDNA第一链样品的合成。

关于碧云天不同反转录酶的比较和选择,可参考相关网页:http://www.beyotime.com/support/reversetranscriptase.htm

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7190S-1 BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶 20μl
D7190S-2 Reaction Buffer(5X) 0.1ml
D7190S-3 RNase Inhibitor (20U/μl) 20μl
D7190S-4 dNTP Mix (10 mM each) 40μl
D7190S-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) 20μl
D7190S-6 Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) 20μl
D7190S-7 DEPC-treated Water 0.3ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7190M-1 BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶 100μl
D7190M-2 Reaction Buffer(5X) 0.5ml
D7190M-3 RNase Inhibitor (20U/μl) 100μl
D7190M-4 dNTP Mix (10 mM each) 200μl
D7190M-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) 100μl
D7190M-6 Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) 100μl
D7190M-7 DEPC-treated Water 1.5ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7190L-1 BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶 500μl
D7190L-2 Reaction Buffer(5X) 2.5ml
D7190L-3 RNase Inhibitor (20U/μl) 500μl
D7190L-4 dNTP Mix (10 mM each) 1ml
D7190L-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) 500μl
D7190L-6 Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) 500μl
D7190L-7 DEPC-treated Water 7.5ml
说明书 1份

保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

对于GC含量比较高的RNA的反转录,产品的使用说明中给予了特别说明,请予以关注。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)。
a.参考如下表格中设置的20μl反转录体系(RNase Inhibitor (R0102)dNTP mix (D7373)可从碧云天订购):
模板(右侧3种任选其中一种) Total RNA 0.1ng-5μg
或poly(A) RNA/mRNA 10pg-0.5μg
或specific RNA 0.01pg-0.5μg
引物(右侧3种任选其中一种) Oligo(dT)18 primer 1 μl
或Random Hexamer primer 1 μl
或gene-specific primer 15-25pmol
DEPC-treated Water - To 12μl*
选择性步骤:如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构,混匀后微离心以把液体沉降至管底,65℃孵育5min,随后立即置于冰上冷却,以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
Reaction Buffer (5X) - 4μl
RNase Inhibitor (20U/μl) - 1μl
dNTP Mix (10mM each) - 2μl
BeyoRT™ QM-MLV反转录酶 - 1μl
总体积 20μl
*To 12μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为12μl。
b.轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c.如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物,42℃孵育10-60min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,先在25℃孵育10min,随后在42℃孵育10-60 min。反转录3kb以下的cDNA,反转录10min即可,反转录3-6kb的cDNA,反转录30min即可,而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。当使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,并且后续用于qPCR时,后续检测任何长度的基因,均反转录10min就足够了。
d.80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶并终止反转录反应。说明:对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶,该方法易导致部分长片断DNA被剪切,此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e.反转录产物可以直接用于后续的qPCR反应等,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为20和50微升,则推荐相应地使用1和2.5微升反转录产物。
2.引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。
常见问题:
1.总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,并且总RNA的反转录产物大小很不均匀,因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2.反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a.PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b.模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0,则提示总RNA发生了显著的降解,最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是,严格进行RNA的相关操作,包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA,以尽量避免RNase污染。
c.模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用碧云天的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d.反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增,通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e.没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA,要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时,需要确保基因特异性引物设计合理正确。
相关产品:
产品编号 产品名称 包装
D7153 BeyoRT™ M-MLV反转录酶 2000U
D7159 BeyoR™ M-MLV反转录酶(RNase H-) 2000U
D7160S BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 10KU
D7160M BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 50KU
D7160L BeyoRT™ II M-MLV反转录酶(RNase H-) 200KU
D7166 BeyoRT™ cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 10次
D7168S BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 20次
D7168M BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 100次
D7168L BeyoRT™ II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-) 500次
D7170S BeyoRT™ II cDNA合成试剂盒(with gDNA Eraser) 20次
D7170M BeyoRT™ II cDNA合成试剂盒(with gDNA Eraser) 100次
D7170L BeyoRT™ II cDNA合成试剂盒(with gDNA Eraser) 500次
D7172 cDNA第二链合成试剂盒 10次
D7176S BeyoRT™ III M-MLV反转录酶 10KU
D7176M BeyoRT™ III M-MLV反转录酶 50KU
D7176L BeyoRT™ III M-MLV反转录酶 200KU
D7178S BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 20次
D7178M BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 100次
D7178L BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 500次
D7180S BeyoRT™ III cDNA合成试剂盒(with gDNAEZeraser) 20次
D7180M BeyoRT™ III cDNA合成试剂盒(with gDNAEZeraser) 100次
D7180L BeyoRT™ III cDNA合成试剂盒(with gDNAEZeraser) 500次
D7182S BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) 20次
D7182M BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) 100次
D7182L BeyoRT™ III cDNA第一链合成预混液(5X) 500次
D7185S BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X, with gDNAEZeraser) 20次
D7185M BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X, with gDNAEZeraser) 100次
D7185L BeyoRT™ III cDNA合成预混液(5X, with gDNAEZeraser) 500次
D7188S BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶 10KU
D7188M BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶 50KU
D7188L BeyoRT™ Q M-MLV反转录酶 200KU
D7190S BeyoRT™ Q cDNA第一链合成试剂盒 20次
D7190M BeyoRT™ Q cDNA第一链合成试剂盒 100次
D7190L BeyoRT™ Q cDNA第一链合成试剂盒 500次
D7205 Taq DNA Polymerase 200U
D7207 Taq DNA Polymerase 1000U
D7216 Pfu DNA Polymerase 200U
D7217 Pfu DNA Polymerase 1000U
D7218 BeyoTaq DNA Polymerase 200U
D7219 BeyoTaq DNA Polymerase 1000U
D7226 GC-rich PCR Buffer(4种套装) 共2ml
D7228 2X PCR Master Mix 400次
D7232 PCR Kit with Taq 400次
D7233 PCR Kit with Taq 2000次
D7237 PCR Kit with BeyoTaq 400次
D7251 Easy-Load™ PCR Master Mix (Blue, 2X) 400次
D7255 Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X) 400次
D7259 Easy-Load™ PCR Master Mix (Orange, 2X) 400次
D7371 dNTP Mixture(2.5mM each) 1ml
D7373 dNTP Mixture(25mM each) 250μl
R0011 Beyozol(总RNA抽提试剂) 100ml
R0016 Trizol(总RNA抽提试剂) 100ml
R0021 DEPC水(DNase、RNase free) 100ml
R0022 DEPC水(DNase、RNase free) 500ml
R0102 RNase Inhibitor 2000U
ST036 DEPC 10g
相关产品请点击如下按钮:
使用本产品的文献:
1. Mei Yang, Yu-Xia Ma, Ying Zhi, Hai-Bin Wang, Li Zhao, Peng-Sheng Wang, Jie-Ting Niu
Eur J Med Res. doi: 10.1186/s40001-022-00703-1. (IF 1.826)