BeyoNGS™ Tn5 Transposase
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产品编号 D7102S
数量
¥ 930.00
产品包装:
800pmol 4000pmol
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碧云天生产的BeyoNGS™ Tn5 Transposase,中文名为BeyoNGS™ Tn5转座酶,是一种来源于E.coli、经过改造具有极高活性的Tn5转座酶突变体,可以高效地将Tn5转座子(Transposon)随机插入到目标序列,对于真核和原核生物的DNA都有极高的转座插入效率。本产品可以特异性识别两端含有嵌合末端序列(Mosaic End sequence, ME)的DNA片段(包括含有ME序列的引物),最终形成Tn5转座体(Tn5 Transposome),该转座体可以随机结合靶DNA并切割插入其携带的DNA片段。Tn5转座酶被广泛用于体外转基因(外源基因整合到宿主细胞)和二代测序(Next Generation Sequencing, NGS)建库等领域。

转座子(Transposon),也称为转座元件(Transposable elements, TEs)、跳跃基因(Jumping genes),是一种可以在基因组中“跳跃”到不同位置的遗传元件(Genetic elements)。尽管转座子经常被称为跳跃基因,转座子还是会相对比较稳定地存在于相应的整合位点,并且大部分转座子最终会变得没有跳跃活性。转座子最早由Barbara McClintock在玉米中发现,并在1983年获得了诺贝尔生理医学奖。后续研究发现转座子系统广泛存在于生物界,并逐渐研究开发成为基因分析的有效工具。

BeyoNGS™ Tn5转座酶是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组蛋白,与野生型Tn5转座酶相比,其插入效率至少提升1000倍,具有转座随机性好、稳定性高、插入位点易测序等特点。

图1. 碧云天的BeyoNGS™ Tn5 Transposase的工作原理图。

BeyoNGS™ Tn5 Transposase与Tn5 Transposase的工作原理相同。Tn5转座酶的工作原理如图1所示。当转座事件发生时,两个Tn5转座酶分子结合到供体DNA (Donor DNA)的转座子的ME序列,形成两个Tn5转座酶分子与供体DNA的复合物①,随后两个Tn5转座酶分子通过C末端相互作用进行联会并环化(Circularization)转座子,形成一个Tn5转座酶二聚体复合物 (Transposase dimer complex)②,在Mg2+存在的条件下,Tn5转座酶切割供体DNA,并携带供体DNA片段离开供体链形成转座体(Transposome)③,当Tn5转座体识别靶点DNA (Target DNA),也称受体DNA (acceptor DNA),并结合到随机靶序列(Target site)上形成转座体与靶序列的复合物④,在Mg2+存在条件下,会对靶序列进行切割,将其携带的供体DNA片段插入靶序列中,形成转座后的DNA序列(Transposed DNA)⑤,切割形成的9bp粘性末端可以通过DNA聚合酶、连接酶作用进行填补,最终两端形成9bp正向重复序列。基因从供体DNA通过Tn5转座酶“剪切”之后“粘贴”到另一受体DNA,实现了基因片段在基因组中的“跳跃”。

产品用途:本产品可用于二代测序(NGS)文库构建时的片段化和加接头;将测序引物引入克隆DNA或质粒;细菌基因敲除库的建立;新型细菌菌株工程改造;目的基因的插入失活;将T7转录启动子、抗性标记等插入靶DNA等。

酶储存溶液:50mM HEPES (pH7.2), 100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% Triton X-100, 50% (v/v) Glycerol。

Reaction Buffer (5X):50mM HEPES (pH7.2), 500mM NaCl, 50mM MgCl2

Stop Buffer (5X):50mM EDTA (pH8.0)。

用于体外转座子插入反应时,按每次使用1μl BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM),本产品小包装D7102S可以进行20次反应,中包装D7102M可以进行100次反应。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7102S-1 BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) 20μl
D7102S-2 Reaction Buffer (5X) 200μl
D7102S-3 Stop Buffer (5X) 300μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7102M-1 BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) 100μl
D7102M-2 Reaction Buffer (5X) 1ml
D7102M-3 Stop Buffer (5X) 1.5ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,一年有效。

注意事项:

BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM)含50%甘油,在-20℃保存不会冻结。须避免-80℃保存,否则会冻结,反复冻融可能会影响Tn5转座酶的活性。

BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM)较为粘稠,吸取时注意取样量准确,加样后请注意充分吹打混匀,避免产生气泡。

BeyoNGS™ Tn5 Transposase催化的底物为DNA,不能用于RNA实验。

本产品用于转座子插入时只适用于细菌,真核细胞由于核膜的阻挡导致转座子难以插入。具体的反应条件请根据相关文献自行设计和调整。

用于细菌相关研究时,请勿使用化学感受态细胞,化学转化的成功概率极低。推荐使用电转化效率不低于106cfu/µg的电转感受态细胞。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.体外转座子插入反应和转化。
a.Tn5转座子的设计。Tn5转座子是两侧带有19bp ME序列的DNA片段,可以使用含有ME序列的上下游引物进行PCR合成。为了获得最佳的转座效率,在两端的PCR引物中需要添加一个5'磷酸基团。典型的Tn5转座子参考图2。
ME序列: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'

图2. Tn5转座子示意图。Tn5转座子其两端为19bp ME序列,ME序列可被BeyoNGS™ Tn5转座酶特异性识别。

b.按照下表制备转座子插入混合物。配制过程中需要注意目标DNA纯度,确保无外源核酸污染。
Component Volume
Reaction Buffer (5X) 2μl
Target DNA* 0.2μg
molar equivalent Tn5 Transposon x μl
BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) 1μl
ddH2O To 10μl
*注:为了避免多余片段的插入,需要计算反应中使用的目标DNA摩尔数,并加入等摩尔量的Tn5转座子片段以减少产生过多插入的可能性。μmol target DNA=μg target DNA/[(base pairs in target DNA)×660],例如:0.2μg 5000bp的目标DNA = 0.2μg/ [5000bp×660]=0.06×10-6μmol = 0.06pmol。
c.混匀后37℃孵育2小时。
d.加入2μl Stop Buffer (5X),混匀后55℃孵育10分钟终止反应。
e.取1μl混合物电击转化到感受态细胞中,根据抗性标记筛选阳性菌株。未使用的混合物可以-20℃保存。推荐的电击转化条件:50μl感受态细胞,1μl混合物,2毫米电击杯,2500V,电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
2.BeyoNGS™ Tn5转座体复合物( BeyoNGS™ Tn5 Transposome complex)的构建和转化后的体内插入。
a.按照下表依次加入相应试剂,制备Tn5转座体复合物混合物。
Component Volume
Tn5 Transposon DNA (100μg/ml in TE Buffer) 2μl
BeyoNGS™ Tn5 Transposase (40μM) 4μl
Glycerol (100%) 2μl
Total Reaction Volume 8μl
注1:本反应无须Mg2+催化,请勿使用D7102-2 Reaction Buffer (5X)。
注2:参考1a中Tn5的转座子设计,Tn5 Transposon DNA为含选择标记(如抗性标记)、成对识别序列(如ME序列)和目标基因的双链DNA,可通过PCR等方法获得。
注3:本反应体系可根据实际需要进行放大或缩小。
b.混匀后室温孵育0.5-1小时。
c.取1μl的转座体复合物电击转化到感受态细胞中,在体内进行插入,并根据抗性标记筛选阳性菌株。推荐的电击转化条件:50μl感受态细胞,1μl转座体复合物 ,2毫米电击杯,2500V,电击时间5毫秒。转化条件可根据该条件的转化效果进行优化。转座的克隆数主要取决于所转化的宿主细胞、内源性的限制修饰系统及感受态细胞的转化效率。
d.构建好的转座体复合物-20℃可以保存1年。
3.构建二代测序所需的BeyoNGS™ Tn5转座体( BeyoNGS™ Tn5 Transposome)。
a.ME和接头(Adapters)的序列。
ME: 5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'
Primer 1: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
Primer 2: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
注:本接头序列参考Nextera® DNA Sample Preparation Kit (Illumina, FC-121-1030),也可按照不同高通量测序的要求进行设计。
b.制备Adapter 1和Adapter 2。
按照下表分别配制Adapter 1和Adapter 2退火反应体系。退火反应后Adapter 1或Adapter 2的终浓度为200μM。
Component Volume
Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251) 10μl
ME (500μM) 20μl
Primer-1 or 2 (500μM) 20μl
Total Reaction Volume 50μl
在PCR仪设置退火反应程序:
Step Temperature
1 95℃, 2min
2 95℃, 8s, -0.1℃ per cycle
3 GOTO step 2, 700 cycles
4 4℃ forever
c.BeyoNGS™ Tn5转座体的制备。
按照下表,将BeyoNGS™ Tn5转座酶、Adapter 1和Adapter 2按摩尔比1:0.5:0.5混合,吹打混匀,室温孵育1小时。注:可根据实验需要适当提高Tn5转座酶的混合比例,但Adapter 1和Adapter 2的浓度需要保持一致。制备好Tn5转座体可直接用于DNA片段化实验,也可以-20℃保存。
Component Volume
BeyoNGS™ Tn5 Transposase 10μl
Adapter 1 (200μM) 1μl
Adapter 2 (200μM) 1μl
d.片段化(Tagmentation)效果测试。
按照下表配制反应体系,轻轻吹打混匀后,55℃孵育5-10分钟。随后加入5μl Stop Buffer (5X),混匀后55℃孵育5分钟终止反应,片段化的产物可用于检测或纯化后建库, 效果参考图3。根据打断片段的大小调整复合体用量,如果片段过长,增加转座体的使用量;如果片段过短,则减少转座体的使用量。
Component Volume
DNA 50-100ng
Tn5转座体 0.5-2μl
Reaction Buffer (5X) 4μl
ddH2O To 20μl

图3. 使用碧云天的BeyoNGS™ Tn5 Transposase制备的Tn5转座体用于DNA随机片段化的效果测试图。在20μl反应体系中,加入100ng Lambda DNA及相应量的Tn5转座体,55℃孵育10分钟,反应完毕入5μl Stop Buffer (5X),混匀后55℃孵育5分钟终止反应,加入5μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071),使用 BeyoGel™琼脂糖预制胶(D0161)进行电泳检测。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

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