T4 Polynucleotide Kinase
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产品编号 D7098M
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¥ 278.00
产品包装:
500U 2000U 10000U
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碧云天生产的T4 Polynucleotide Kinase,简称T4 PNK,中文名称T4多聚核苷酸激酶,是一种多聚核苷酸5'羟基激酶,可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其它NTP也可产生相同的反应:5'-OH + NTP → 5'-P + NDP。

上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下,T4 Polynucleotide Kinase可以显示出5'磷酸酯酶的活性,催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其它NTP也可产生相同的反应:5'-P + NDP → 5'-OH + NTP (最适pH为6.4左右)。

当ATP和ADP都适量存在时,T4 Polynucleotide Kinase可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。其它NTP也可产生相同的反应:5'-P + NTP + NDP → 5'-P + NDP + NTP。

T4 Polynucleotide Kinase同时具有3'磷酸酯酶活性,可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化:3'-P → 3'-OH + Pi (最适pH为5.9左右)。

T4 Polynucleotide Kinase的激酶活性在N-末端附近,而磷酸酯酶活性在C-末端附近。

碧云天生产的T4 Polynucleotide Kinase催化单链DNA 5'端磷酸化的效果请参考图1。

图1.碧云天生产的T4 Polynucleotide Kinase催化单链DNA 5'端磷酸化的效果图。使用本产品或N公司(Competitor)的T4 Polynucleotide Kinase,在50µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的T4 Polynucleotide Kinase,37℃孵育30min进行反应,65℃孵育20min以终止反应。取出20μl反应液,用增强型ATP检测试剂盒(S0027)检测反应体系中剩余ATP的浓度,根据反应体系中剩余ATP的浓度计算出反应体系中剩余ATP的量,根据反应体系中剩余ATP的量和初始加入的总量计算出反应体系中消耗掉的ATP量,消耗掉的ATP量可以反映T4 Polynucleotide Kinase的活性。以反应体系中加入的酶量为横坐标,消耗掉的ATP量为纵坐标作图。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化单链DNA 5'端磷酸化效果。反应体系(50μl): 70mM Tris-HCl (pH7.6 at 25℃), 10mM MgCl2, 5mM DTT, 2µM ATP, 2µM ssDNA,以及加入1µl不同浓度的T4 Polynucleotide Kinase。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

用途:寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记,用作Southern、Northern、EMSA等的探针,凝胶电泳的marker,DNA测序引物,PCR引物等;使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化,确保后续连接反应顺利进行;催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化,使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接;去除3'端磷酸基团。

来源:由大肠杆菌表达,表达基因的来源为T4嗜菌体。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme catalyzing the incorporation of 1 nmol of phosphate from ATP to 5’-OH DNA in 30 minutes at 37℃。

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶。

酶储存溶液:10mM Tris-HCl (pH7.4), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1µM ATP, 50% glycerol。

T4PNK Buffer (10X):700mM Tris-HCl (pH7.6 at 25℃), 100mM MgCl2, 50mM DTT。

缓冲液兼容性:在碧云天的内切酶反应缓冲液1X G、1X O、1X Y 、2X Y中的活性为100%,在1X B、1X R中的活性为75-100%;在碧云天的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反应缓冲液中的活性为50-100%。

失活或抑制:75℃加热10min或65℃加热20min或可使T4 Polynucleotide Kinase失活,加入EDTA也可使T4 Polynucleotide Kinase失活。金属离子螯合剂、磷酸盐、铵根离子、大于50mM的KCl和NaCl均可显著抑制T4 Polynucleotide Kinase的活性。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7098S-1 T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) 50µl
D7098S-2 T4PNK Buffer (10X) 150µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7098M-1 T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) 200µl
D7098M-2 T4PNK Buffer (10X) 500µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7098L-1 T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) 1ml
D7098L-2 T4PNK Buffer (10X) 2ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少2年有效。

注意事项:

铵盐沉淀获得的DNA不能用于T4 Polynucleotide Kinase的标记反应。铵盐可强烈抑制T4 Polynucleotide Kinase的酶活性。

PEG可促进磷酸化反应速率和效率;交换反应体系应加入PEG。

酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.DNA 5'末端标记:
a.参考如下表格设置反应体系:
Reagent Volume
DNA to be phosphorylated 1-20pmol
T4PNK Buffer A (10X) 2µl
-32P or γ-33P]-ATP (3,000Ci/mmol) 20pmol
Nuclease-free Water to 19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) 1µl
b.按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c.37℃孵育30min。
d.加入1µl 0.5M EDTA (pH 8.0)混匀,以终止反应。
e.后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
2.DNA 5'末端磷酸化:
a.参考如下表格设置反应体系:
Reagent Volume
DNA to be phosphorylated 1-20pmol
T4PNK Buffer A (10X) 2µl
0.1mM ATP 1µl
Nuclease-free Water to 19µl
T4 Polynucleotide Kinase (10U/µl) 1µl
b.按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c.37℃孵育30min。
d.加入1µl 0.5M EDTA (pH 8.0)混匀,以终止反应。
e.后续可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化标记的DNA,也可以使用适当的DNA纯化试剂盒进行纯化。DNA纯化试剂盒(D0033)可以向碧云天订购。
3.其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。
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