碧云天生产的BeyoCRISPR™ Quick Construction Kit (CD4 Enrichment)，即BeyoCRISPR™快速构建试剂盒(CD4富集)，是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术而研发的用于构建表达Cas9和特定guide RNA (gRNA)的哺乳动物表达质粒的快速构建试剂盒。用户仅需按照使用说明设计并合成靶基因特异性的寡核苷酸(Target-specific DNA oligos)，然后经过退火形成双链后，连接至本试剂盒提供的线性化载体中，即可构建成用于目的基因基因编辑的完整质粒。质粒构建成功并转染哺乳动物细胞后，可以通过CD4抗原进行Cas9和gRNA表达阳性细胞的筛选，阳性细胞中通常就会出现预期的目的基因的基因编辑。
CRISPR/Cas9是一项突破性的基因组编辑技术，操作便捷，应用广泛。CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用RNA引导的DNA核酸酶Cas9对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(Adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原核和真核生物的越来越成熟的基因编辑技术。该技术能够在gRNA引导下通过Cas9对原核和真核生物的基因组DNA的靶向序列进行位点特异性的切割，然后通过易错修复(Error-prone repair)或同源重组(Homologous recombination)在切割位点改变或插入序列来产生移码突变，从而通过基因编辑而实现基因敲除。其中gRNA确保识别位点的特异性。随着CRISPR技术的发展，该技术目前不仅可以实现基因敲除，还可以实现基因的点突变、插入突变等多种突变方式，特别是在临床应用方面可以用于修复不良突变等[1,2]。同时通过构建没有内切酶活性的Cas9突变体dCas9，通过与dCas9直接融合表达或间接招募转录激活或转录抑制因子，可以实现sgRNA靶向基因的转录激活或转录抑制。
CRISPR/Cas9系统由Cas9 Nuclease和gRNA复合物所组成。gRNA，也称sgRNA (Single guide RNA)，由18-20bp与靶基因序列互补的CRISPR RNA (crRNA)序列以及能与Cas9特异性结合的Trans-activating crRNA (tracrRNA)序列组成。gRNA通过与靶序列之间的互补配对，将Cas9 Nuclease引导至靶DNA，Cas9 Nuclease C端的与PAM (Proto-spacer adjacent motif)相互作用的结构域(PAM-interacting domain)识别富含G碱基(5'-NGG-3')的PAM序列，在HNH和RuvC两个结构域的协同作用下，在PAM序列NGG上游大约三个碱基处产生DNA的双链断裂(Double-strand break, DSB)。如果该双链DNA断裂发生在细胞内，在细胞DNA修复过程中会导致基因靶位点处的插入、删除或替换，从而可能产生移码突变，导致目的基因的缺失突变(图1) [1]。
图1. CRISPR/Cas9基因编辑示意图。
本试剂盒中提供的Linearized pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4同时表达靶向目的基因的gRNA、Cas9，以及CD4。CD4是辅助性T细胞的标志性蛋白，在免疫反应中起着至关重要的作用，并同时在细胞内外环境受到干扰时发挥多种功能，可以参与胸腺中辅助T细胞的发育，并触发单核细胞分化为功能成熟的巨噬细胞。可以利用CD4的抗原特性进行磁珠富集表达Cas9和gRNA的细胞，也可以对表达Cas9和gRNA的细胞通过对CD4的荧光标记进行流式细胞分选和单细胞克隆筛选。本质粒在Cas9和CD4的编码序列之间含有T2A肽序列。T2A是一个可以被理解为含有18个氨基酸残基(EGRGSLLTCGDVEENPGP)的“自剪切”小肽，但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过T2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游Cas9蛋白的C端将会添加一些额外的T2A残基(GSGEGRGSLLTCGDVEENPG)，而下游CD4蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在T2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率。
pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4质粒为氨苄青霉素抗性。
pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4质粒图谱如下。
图2. pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4质粒图谱。
碧云天BeyoCRISPR™ Quick Construction Kit (CD4 Enrichment)的连接效果如图3所示。
图3. 碧云天BeyoCRISPR™ Quick Construction Kit (CD4 Enrichment) (D7086)的连接实测效果图。如图所示，左侧为使用本试剂盒连接后转化DH5α感受态细胞后涂板获得的LB平板的实测效果图，右侧为菌落PCR鉴定的结果。在10μl反应体系中，将2μl Linearized pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4 (15ng/μl)和1μl ds Control Oligo (50nM) (试剂盒中提供的为10μM，需事先用超纯水或ddH2O稀释)混合，然后加入1μl的10X Quick Construction Buffer，0.5μl的Quick Ligase，并用超纯水或ddH2O补足至10μl，在室温下孵育10分钟后，取10μl转化至100μl的DH5α感受态细胞中。实验结果表明，使用本试剂盒在室温下连接10分钟即可得到较多的克隆数，且阳性率可达100%。菌落PCR引物为hU6-F Primer和sgRNA oligo reverse primer，PCR扩增片段大小为274bp。实际检测效果会因实验条件的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4质粒可使用的测序引物序列如下：
hU6-F Primer: 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D7086-1 | Linearized pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4 (15ng/μl) | 20µl |
| D7086-2 | Ultrapure Water | 2ml |
| D7086-3 | 10X Quick Construction Buffer | 100µl |
| D7086-4 | Quick Ligase | 20µl |
| D7086-5 | ds Control Oligo (1μM) | 10µl |
| D7086-6 | hU6-F Primer (10μM) | 50µl |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃保存，两年有效。
注意事项：对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。
普通连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65℃孵育10分钟使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(Band shift)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
图4. DNA序列示例。
b.单链DNA oligos的设计，请参考图5。
图5. 单链DNA oligo示例。
2.合成双链oligo。| Reagent | Volume |
| sgRNA oligo forward (100μM) | 1µl |
| sgRNA oligo reverse (100μM) | 1µl |
| 10X Quick Construction Buffer | 1µl |
| Ultrapure Water | 7µl |
| Total Volume | 10µl |
| Step | Temperature | Time | Note |
| 1 | 95℃ | 2min | 让oligos充分变性 |
| 2 | -0.1℃/8sec, to 25℃ | About 90min | 退火 |
| 3 | 4℃ | Hold | 暂时存放 |
| Reagent | Volume |
| Linearized pU6-gRNA-Cas9-T2A-CD4 (15ng/μl) | 2µl |
| 50nM ds oligo | 1µl |
| 10X Quick Construction Buffer | 1µl |
| Ultrapure Water | 5.5µl |
| Quick Ligase | 0.5µl |
| Total Volume | 10µl |
