Bsu DNA Polymerase, Large Fragment
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产品编号 D7055S
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¥ 163.00
产品包装:
200U 1000U
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碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment,即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, Bsu) DNA聚合酶大片段,具有5'→3' DNA聚合酶活性,不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bsu DNA聚合酶大片段具有链置换 (strand displacement)活性,常用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA),其等温扩增(isothermal amplification)的温度通常为37℃。

Bsu DNA Polymerase, Large Fragment是将枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'核酸外切酶结构域(1-296 aa)删除后表达剩余蛋白序列而获得的。该酶保留了枯草芽孢杆菌DNA 聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但是缺失了5'→3'核酸外切酶和3'→5'核酸外切酶活性。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)主要包括以下几个组分:重组酶(recombinase) T4 UvsX,重组酶载入因子(recombinase loading factor) T4 UvsY,Bsu DNA聚合酶大片段以及单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein)T4 gp32。在ATP存在的情况下,UvsX与引物相结合,扫描DNA模板,寻找到与引物配对的核酸序列,一旦引物被定位到了DNA模板的同源序列,ATP水解产生ADP,ADP与UvsX的结合导致UvsX被gp32取代而从DNA模板上解离下来,gp32作为单链结合蛋白可以稳定被置换的DNA链的结构,Bsu DNA聚合酶大片段因引物与DNA模板的配对而进行引物的延伸和模板的扩增。重组酶载入因子T4 UvsY和拥挤试剂(crowding reagent) Carbowax20M的加入有利于UvsX与引物的结合,即有利于重组酶UvsX的载入。

碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果请参考图1。

图1.碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果图。使用本产品或竞争(Competitor) N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment,在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment,37℃孵育15min进行反应。反应完毕后冰浴3-5min,75℃孵育20min以终止反应。取出5μl反应液,加入1μl 6X DNA Loading Buffer,然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60min);之后用Gel-Red (D0140)室温染色15min,然后进行拍照记录。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化效果。反应体系(20μl):10mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃), 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 125µM dNTP Mix, 0.5µM Template/Primer (Template: 5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3 / Primer: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3');Primer和Template按照D0251产品说明书中推荐的程序进行退火反应,之后以Primer/Template退火产物为底物,进行DNA模板的延伸。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。

用途:RPA法等温扩增;RPA链置换的DNA合成;随机引物法标记;cDNA第二条链合成;单个dA的加尾。

来源:大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I基因(297-880 aa)获得的重组蛋白。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate10 nmol dNTPs into acid insoluble material in 30 minutes at 37℃.

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含核糖核酸酶。

酶储存液:25 mM Tris-HCl (pH7.4), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol.

10XReaction Buffer: 100 mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃), 500 mM NaCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT.

失活或抑制:75℃孵育20min。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7055S-1 Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) 40µl
D7055S-2 10X Bsu Reaction Buffer 100µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7055M-1 Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) 200µl
D7055M-2 10X Bsu Reaction Buffer 500µl
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

由于缺乏3'→5'核酸外切酶活性,Bsu DNA Polymerase, Large Fragment不能切除3'未配对的突出末端,因而不适用于产生平末端。

Bsu DNA Polymerase, Large Fragment 25℃时仍保留50%的DNA聚合酶活性,是相同温度下Klenow片段(3'→5' exo-)活力的两倍。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.Primer/Template杂合双链的退火。
将单链Primer和DNA Template等摩尔数混合,推荐的终浓度为10µM,90℃孵育1min,然后通过梯度降温至25℃退火形成Primer/Template杂交双链。推荐使用碧云天生产的D0251 Annealing Buffer for DNA Oligos (5X),并按照该产品使用说明进行退火反应。退火后的双链可以直接用于后续实验,或在-20℃保存备用。
2.对于DNA模板链的延伸,参考下表在冰浴中配制反应体系。
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-Free Water 15µl -
Annealed Primer/template (10µM each) 1µl 0.5µM each
Bsu Reaction Buffer (10X) 2µl 1X
dNTP Mix (2.5mM each) 1µl 125µM
Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) 1µl 0.25U/µl
Total Volume 20µl -
注:如果同时进行多个反应,可把上表中除Annealed Primer/template之外的所有组分预先混合,然后再分装到各反应管。
3.反应条件:37℃孵育适当时间。参考图1,其中的孵育时间为15min。该酶延伸速率预计和常规DNA聚合酶类似,大约1000bp/分钟。具体使用时需要适当摸索孵育时间,以确定比较合适的延伸时间。
4.终止反应:75℃孵育20min以终止反应。
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