碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment,即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, Bsu) DNA聚合酶大片段,具有5'→3' DNA聚合酶活性,不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bsu DNA聚合酶大片段具有链置换 (strand displacement)活性,常用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA),其等温扩增(isothermal amplification)的温度通常为37℃。
Bsu DNA Polymerase, Large Fragment是将枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I的5'→3'核酸外切酶结构域(1-296 aa)删除后表达剩余蛋白序列而获得的。该酶保留了枯草芽孢杆菌DNA 聚合酶I的5'→3'聚合酶活性,但是缺失了5'→3'核酸外切酶和3'→5'核酸外切酶活性。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)主要包括以下几个组分:重组酶(recombinase) T4 UvsX,重组酶载入因子(recombinase loading factor) T4 UvsY,Bsu DNA聚合酶大片段以及单链DNA结合蛋白(single-strand binding protein)T4 gp32。在ATP存在的情况下,UvsX与引物相结合,扫描DNA模板,寻找到与引物配对的核酸序列,一旦引物被定位到了DNA模板的同源序列,ATP水解产生ADP,ADP与UvsX的结合导致UvsX被gp32取代而从DNA模板上解离下来,gp32作为单链结合蛋白可以稳定被置换的DNA链的结构,Bsu DNA聚合酶大片段因引物与DNA模板的配对而进行引物的延伸和模板的扩增。重组酶载入因子T4 UvsY和拥挤试剂(crowding reagent) Carbowax20M的加入有利于UvsX与引物的结合,即有利于重组酶UvsX的载入。
碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果请参考图1。
图1.碧云天生产的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment催化延伸DNA模板的效果图。使用本产品或竞争(Competitor) N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment,在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的Bsu DNA Polymerase, Large Fragment,37℃孵育15min进行反应。反应完毕后冰浴3-5min,75℃孵育20min以终止反应。取出5μl反应液,加入1μl 6X DNA Loading Buffer,然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180V电泳60min);之后用Gel-Red (D0140)室温染色15min,然后进行拍照记录。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化效果。反应体系(20μl):10mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃), 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 125µM dNTP Mix, 0.5µM Template/Primer (Template: 5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3 / Primer: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3');Primer和Template按照D0251产品说明书中推荐的程序进行退火反应,之后以Primer/Template退火产物为底物,进行DNA模板的延伸。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异,图中所示结果仅供参考。
用途:RPA法等温扩增;RPA链置换的DNA合成;随机引物法标记;cDNA第二条链合成;单个dA的加尾。
来源:大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I基因(297-880 aa)获得的重组蛋白。
活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate10 nmol dNTPs into acid insoluble material in 30 minutes at 37℃.
纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含核糖核酸酶。
酶储存液:25 mM Tris-HCl (pH7.4), 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% (v/v) Glycerol.
10XReaction Buffer: 100 mM Tris-HCl (pH7.9 at 25℃), 500 mM NaCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT.
失活或抑制:75℃孵育20min。
包装清单:产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D7055S-1 | Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) | 40µl |
D7055S-2 | 10X Bsu Reaction Buffer | 100µl |
- | 说明书 | 1份 |
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D7055M-1 | Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) | 200µl |
D7055M-2 | 10X Bsu Reaction Buffer | 500µl |
- | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项:由于缺乏3'→5'核酸外切酶活性,Bsu DNA Polymerase, Large Fragment不能切除3'未配对的突出末端,因而不适用于产生平末端。
Bsu DNA Polymerase, Large Fragment 25℃时仍保留50%的DNA聚合酶活性,是相同温度下Klenow片段(3'→5' exo-)活力的两倍。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
Reagent | Volume | Final Concentration |
Nuclease-Free Water | 15µl | - |
Annealed Primer/template (10µM each) | 1µl | 0.5µM each |
Bsu Reaction Buffer (10X) | 2µl | 1X |
dNTP Mix (2.5mM each) | 1µl | 125µM |
Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (5U/µl) | 1µl | 0.25U/µl |
Total Volume | 20µl | - |
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D7050S | Bst DNA Polymerase, Large Fragment | 800U |
D7050M | Bst DNA Polymerase, Large Fragment | 4000U |
D7053S | phi29 DNA Polymerase | 250U |
D7053M | phi29 DNA Polymerase | 1kU |
D7053L | phi29 DNA Polymerase | 5kU |
D7053XL | phi29 DNA Polymerase | 20kU |
D7055S | Bsu DNA Polymerase, Large Fragment | 200U |
D7055M | Bsu DNA Polymerase, Large Fragment | 1000U |
D7359-250µl | dUTP (100mM) | 250µl |
D7359-1ml | dUTP (100mM) | 1ml |
D7360S | Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) | 1000U |
D7360M | Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) | 5000U |
D7362S | Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium) | 100U |
D7362M | Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium) | 500U |
D7364S | Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) | 200U |
D7364M | Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) | 1000U |
D7364L | Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) | 5000U |
D7371 | dNTP Mixture (2.5mM each) | 1ml |
D7373 | dNTP Mixture (25mM each) | 250μl |
D7376-1ml | dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM) | 1ml |
D7376-5ml | dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM) | 5ml |