phi29 DNA Polymerase
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产品编号 D7053XL
数量
¥ 6215.00
产品包装:
250U 1kU 5kU 20kU
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碧云天生产的phi29 DNA Polymerase,即phi29 DNA聚合酶,是一种重组表达纯化的源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis噬菌体phi29的DNA聚合酶。phi29 DNA聚合酶具有DNA链置换 (strand displacement) 活性和很强的DNA连续合成能力(processive synthesis property),可以合成超过70kb的长度,常用于在体外进行不依赖于热循环的等温DNA扩增(isothermal DNA amplification,也常简称为等温扩增)。

phi29 DNA Polymerase具有很强的链亲和力,单次聚合反应可以实现长度超过70kb的连续聚合延伸,从而适合用于对全基因组进行稳定扩增。phi29 DNA Polymerase虽然可以扩增线状或者环状的双链DNA,但其底物倾向于是单链DNA或单链RNA。phi29 DNA Polymerase具有3'→5'外切酶活性,因此可保证扩增反应的高保真性。

用途:phi29 DNA Polymerase可用于高保真等温PCR、滚环复制(Rolling Circle Replication,RCA),多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)和单细胞、病原微生物以及宏基因组(metagenome)的全基因组扩增(Whole Genome Amplification,WGA)、干血斑样本扩增DNA、单细胞基因组扩增、SNP基因分型和STR/微卫星分析等。phi29 DNA Polymerase还可应用于protein-primed DNA扩增、RNA-primed DNA扩增,以及致死基因的无细胞体系的克隆等相关实验。

碧云天生产的phi29 DNA Polymerase在3-16小时内可实现对动物细胞基因组、环状质粒以及线性单链DNA的有效扩增(图1,图2和图3)。

图1. 碧云天生产的phi29 DNA Polymerase和国外N公司的同类产品(Competitor phi29 DNA Polymerase)催化Hela细胞基因组DNA扩增效果对比图。图A为30℃孵育2h效果图,图B为30℃孵育16h效果图。反应体系为20μl:2μl 10X Reaction Buffer,1μl Random Hexamer Primer (100 μM),1μl dNTP (2.5 mM each),1μl Hela细胞基因组DNA (20 ng/μl),14μl Nuclease-free Water,95℃孵育5 min,冰浴2 min后加入1μl不同稀释倍数 (1、2、4、8、16倍稀释)的phi29 DNA Polymerase,反应完毕后,加入4μl 6X DNA Loading buffer (D0071, Beyotime),取10μl反应产物,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果。1. 未添加Hela细胞基因组DNA但加入正常量的phi29 DNA Polymerase;2. 未添加phi29 DNA Polymerase;3-7分别为phi29 DNA Polymerase的稀释倍数为1、2、4、8和16倍。从上图的检测效果来看,碧云天生产的phi29 DNA Polymerase能很好地扩增基因组DNA,并且其扩增效果优于国外N公司的同类产品。

来源:碧云天生产的phi29 DNA Polymerase由大肠杆菌重组表达Bacillus subtilis噬菌体phi29 DNA Polymerase,并通过纯化所得,该酶分子量约为67kDa。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 0.5 pmol of dNTP into acid insoluble material in 10 minutes at 30℃。

图2. 碧云天生产的phi29 DNA Polymerase和国外N公司的同类产品(Competitor phi29 DNA Polymerase)催化环状质粒DNA pCMV-N-DsRed (4959bp, D2705)扩增效果对比图。图A为30℃孵育2h效果图,图B为30℃孵育16h效果图。反应体系为20μl:2μl 10X Reaction Buffer,1μl Random Hexamer Primer (100 μM),1μl dNTP (2.5 mM each),1μl 5kb环状质粒DNA (pCMV-N-DsRed,5 ng/μl),14μl Nuclease-free Water,95℃孵育5 min,冰浴2 min后加入1μl不同稀释倍数 (1、2、4、8、16倍稀释)的phi29 DNA Polymerase,反应完毕后,加入4μl 6X DNA Loading buffer (D0071),取10μl反应产物,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果。1. 未添加pCMV-N-DsRed但加入正常量的phi29 DNA Polymerase;2. 未添加phi29 DNA Polymerase;3-7分别为phi29 DNA Polymerase的稀释倍数为1、2、4、8和16倍。从上图的检测效果来看,碧云天生产的phi29 DNA Polymerase能很好地扩增质粒,并且其扩增效果优于国外N公司的同类产品。

图3. 碧云天生产的phi29 DNA Polymerase和国外N公司的同类产品(Competitor phi29 DNA Polymerase)催化线性单链DNA扩增效果对比图。图A为反应2h效果图,图B为反应16h效果图。反应体系为20μl:2μl 10X Reaction Buffer,1μl Random Hexamer Primer (100 μM),1μl dNTP (2.5 mM each),1μl M13单链DNA (5ng/μl),14μl Nuclease-free Water,95℃孵育5 min,冰浴2 min后加入1μl不同稀释倍数(1、2、4、8、16倍稀释)的phi29 DNA Polymerase。反应完毕后,加入4μl 6X DNA Loading buffer (D0071, Beyotime),取10μl反应产物,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果。1. 未添加M13单链DNA但加入正常量的phi29 DNA Polymerase;2. 未添加phi29 DNA Polymerase;3-7分别为phi29 DNA Polymerase的稀释倍数为1、2、4、8和16倍。从上图的检测效果来看,碧云天生产的phi29 DNA Polymerase能很好地扩增单链DNA,并且其扩增效果优于国外N公司的同类产品。

10X Reaction Buffer:500 mM Tris-HCl (pH7.5 at 25℃), 100 mM MgCl2, 100mM (NH4)2SO4 , 40 mM DTT。

酶储存溶液:10 mM Tris-HCl (pH7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, 0.5% Tween20,0.5% Nonidet P-40。

纯度:不含DNA内切酶活性和RNase活性,不含蛋白酶活性。

失活或抑制:65℃热孵育10min即可失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7053S-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 25µl
D7053S-2 10X Reaction Buffer 100µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7053M-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 100µl
D7053M-2 10X Reaction Buffer 300µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7053L-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 500µl
D7053L-2 10X Reaction Buffer 1.5ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7053XL-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 2ml
D7053XL-2 10X Reaction Buffer 6ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

DTT浓度对于phi29 DNA Polymerase活力影响较大,当10X Reaction Buffer储存时间较长或经反复冻融后,可在反应体系中补充DTT至终浓度为5 mM。

由于phi29 DNA Polymerase具有较强的3'→5'外切酶活力,建议合成引物时对其3'端进行硫代磷酸酯键修饰,或使用高浓度的随机引物,以降低外切酶活力对引物的切割效应。

phi29 DNA Polymerase具有很高的灵敏度及扩增效率,请使用Nuclease-free的枪头和PCR管,并避免其它反应组分污染。建议在进行扩增反应的同时设置无DNA模板的阴性对照,以确保无外源DNA的污染。若阴性对照出现背景,请先将整个反应体系,除了DNA模板和phi29 DNA Polymerase外,先95℃加热变性2min,然后置于冰浴冷却,随后加入phi29 DNA Polymerase,混匀后30℃孵育30min,以充分利用phi29 DNA Polymerase的外切酶活性去除污染的DNA模板背景,然后再加入DNA模板样品进行预期的扩增。

对于酶的操作需在冰浴上进行,以避免酶在室温长时间放置而影响酶的活性。

进行等温扩增时,需自备额外的试剂,例如如2.5 mM dNTP、Random Hexamer Primer (100μM)以及Nuclease-free Water等。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.参考下表,在冰浴上配制反应体系。
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-free Water (15-x)µl -
10X Reaction Buffer 2 µl 1X
dNTP (2.5 mM each) 1 µl 125µM
Random Hexamer Primers (100μM) 1 µl 5μM
Template DNA (≥1 ng)* x μl -
Total Volume 19µl -
a.上表以20µl体系为例,如果有多个类似反应,可以根据实验需求先配制大体积的反应体系,用移液器轻轻吹打或Vortex混匀后分装到各PCR反应管内。
b.对于基因组DNA,建议模板DNA的终浓度为20ng/µl;对于质粒,建议模板DNA的终浓度为5ng/µl;对于M13单链DNA,建议模板DNA终浓度为5ng/µl。
c.由于phi29 DNA Polymerase具有较强的3'→5'外切酶活性,如果出现扩增效果不佳的现象,建议将反应体系中的酶量降低至0.5μl或0.25μl。
2.模板DNA的预变性:将上述反应体系置于PCR仪中95 ℃孵育5min,迅速置于冰浴2min或更长时间。
3.恒温扩增反应:在冷却的反应体系中加入1μl phi29 DNA Polymerase,30℃孵育2-16h。通常孵育2h即可,如果希望获得更大量的扩增产物,可延长孵育时间至16h。推荐使用恒温水浴锅进行反应,如果使用热盖式PCR仪进行反应,请将热盖温度调整为40℃,以避免酶失活。
4.终止反应:65℃孵育10 min。
5.扩增产物的检测:将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测扩增效果。
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