Bst DNA Polymerase, Large Fragment
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产品编号 D7050M
数量
¥ 516.00
产品包装:
800U 4000U
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碧云天生产的Bst DNA Polymerase, Large Fragment,即嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus, Bst) DNA Polymerase I大片段,具有5'→3' DNA聚合酶活性,不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bst DNA Polymerase, Large Fragment具有很强的链置换(strand displacement)能力,可应用于核酸的等温扩增反应,如环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和滚环扩增(Rolling-circle amplification, RCA)等。

Bst DNA Polymerase, Large Fragment介导的等温扩增温度一般在50-68℃之间,通常为65℃。与Bst DNA Polymerase 2.0相比,本产品在进行等温扩增时不具有将dUTP掺入合成的DNA链的能力。

Bst DNA Polymerase具有5'→3'的核酸外切酶活性,而Bst DNA Polymerase, Large Fragment通过删除突变而缺失了5'→3'核酸外切酶活性。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 65℃。

碧云天生产的Bst DNA Polymerase, Large Fragment酶活性参考图1。

图1. 碧云天Bst DNA Polymerase, Large Fragment进行环介导等温扩增反应的效果。使用本产品或N公司的Bst DNA Polymerase, Large Fragment,在25µl体系,分别以不同量的(10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 ng)烟草花叶病毒的CaMV35启动子为模板,8U的Bst DNA Polymerase, Large Fragment (图1中简写为Bst),引物:1.6µM FIP/BIP、0.2µM F3/B3、0.4µM LoopF/B,1.4mM dNTP each,在1X Bst Reaction Buffer中补加MgSO4至终浓度为8mM,65℃孵育1h,80℃加热20min灭活,然后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示,本产品与Competitor N公司的产品相比,具有略好或至少相当的酶活性效果。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。

来源:Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I的大片段通过大肠杆菌重组表达和纯化而获得。

纯度:无DNA内切酶和外切酶活性。

用途:环介导等温扩增LAMP、解旋酶等温基因扩增(HDA)等DNA等温扩增,多重置换扩增(MDA),全基因组扩增(WGA),高GC含量DNA的测序,纳克级DNA模板的快速测序,建库测序等。

酶储存溶液:10mM Tris-HCl (pH7.5), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% Triton X-100, 50% (v/v) glycerol。

10X Bst Reaction Buffer:200mM Tris-HCl, 100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 20mM MgSO4, 1% Triton X-100, pH8.8 at 25°C。

失活或抑制:80℃加热20min。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7050S-1 Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8U/μl) 100µl
D7050S-2 10X Bst Reaction Buffer 300µl
D7050S-3 100mM MgSO4 200µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7050M-1 Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8U/μl) 500µl
D7050M-2 10X Bst Reaction Buffer 1.5ml
D7050M-3 100mM MgSO4 1ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存。

注意事项:

Bst DNA Polymerase, Large Fragment不具有3'→5'核酸外切酶活性。

建议等温扩增反应温度不能高于70℃,否则会导致酶失活。

Bst DNA Polymerase,Large Fragment不能用于热循环测序和PCR。

每次等温扩增实验注意设置无模板DNA作为阴性对照。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.引物设计:
环介导的等温扩增引物的设计可以参考http://primerexplorer.jp/e/,建议使用V5版本。具体操作手册可以在http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html下载。环介导等温扩增引物的初步筛选可参照该操作手册,具体需要通过实验来验证比较合适的引物。LAMP引物由4个或6个(含Loop)引物组成,建议加入Loop环引物设计,即设计6条引物进行实验。
2.以LAMP等温扩增为例,参考下表设置反应体系。
Reagent Volume Final concentration
Nuclease-Free Water (13.5-x)μl -
10X Bst Reaction Buffer 2.5μl 1X
MgSO4 (100mM) 1.5μl 6mM (8mM total)
dNTP (10mM each) 3.5μl 1.4mM each
FIP/BIP Primers (25X, 40μM) 1μl 1.6μM
F3/B3 Primers (25X, 5μM) 1μl 0.2μM
LoopF/B Primers (25X, 10μM) 1μl 0.4μM
Template xμl >10 copies or more
Bst DNA Polymerase, Large Fragment (8U/μl) 1μl 320U/ml
Total volume 25μl -
注1:在配制反应体系完成后,可每25μl体系的反应管管盖加适量高浓度的SYBR Green I 1μl,待等温扩增反应结束后,8000g离心1min,反应体系变荧光绿为阳性,保持无色或棕色为阴性。也可以无需添加指示剂,待反应程序结束后,可见反应液明显变浑浊为阳性,反应液保持透明为阴性。
注2:如需优化反应,可调整Mg2+浓度(4-10mM),酶量(0.04-0.32U/μl)或改变反应温度(50-68℃)。
注3:如果通过琼脂糖凝胶电泳或其它需要打开LAMP反应容器的方法进行分析,请设置辅助分析区域和设备,以避免污染。
注4:由于反应比较迅速,为了确保实验的重现性,建议模板DNA最后加入。
注5:强烈建议设置未加模板的阴性对照,以确保扩增的特异性。
注6:为了防止在配置试剂时发生污染,请务必在超净工作台内进行操作。
注7:试剂及模板DNA的配置操作尽量需要和PCR产物的电泳等分析在不同的区域进行,以免发生污染。
3.反应程序:65℃ 60min。
4.灭活:80℃ 20min。
5.如实验需要,可以用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析,电泳图显示扩增产物为梯度条带为阳性,无梯度条带为阴性。
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