碧云天生产的Recombinant E.coli RecA Protein，即重组大肠杆菌RecA蛋白，也称E.coli RecA，是碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种大肠杆菌内源性表达的对于DNA损伤修复和紫外诱导的突变过程中的遗传重组起关键作用的酶。RecA的合成是由DNA损伤导致的SOS反应诱导的。RecA具有单链DNA依赖的ATP酶活性，在同源重组反应的过程中，会形成D-loop和Holliday structure；它还具有coprotease活性，并促进LexA抑制子、lambda噬菌体抑制子和UmuD蛋白的自剪切。RecA在真核生物中的同源蛋白是Rad51和Dmc1[1]。E.coli RecA蛋白可用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)[2]。

体外研究所必需的表明，在ATP存在的情况下，E.coli RecA蛋白首先与单链DNA结合形成核蛋白丝，核蛋白丝与双链DNA结合形成突触丝，突触丝打开双链体并寻找同源链，之后催化互补链的交换，结合E.coli RecA蛋白的单链DNA与互补链DNA从5′→3′方向进行互补配对最终形成新的异源双链体并发生分叉迁移[3]。

用途：电镜下DNA结构的可视化，D-loop突变，利用E.coli RecA蛋白结合的探针进行DNA文库筛选，在单个指定位点进行DNA酶切，介导全长cDNA克隆的亲和捕获，同源重组机制及SOS反应研究，重组酶聚合酶扩增。

来源：纯化自携带recA基因的E.coli重组菌株。

分子量：约为38kDa。

纯度：纯度≥ 95%，且不含DNA内切酶和外切酶、不含RNA酶、不含磷酸酯酶。

浓度：2mg/ml。

酶储存溶液：10 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, pH7.4 @ 25ºC。

10X RecA Reaction Buffer：700mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 50mM DTT, pH7.6 @ 25ºC。

失活或抑制：65ºC孵育20分钟可使E.coli RecA蛋白失活。

碧云天E.coli RecA蛋白酶活性检测效果参考图1。

图1.碧云天Recombinant E.coli RecA Protein (D7025)活性鉴定结果图。在10µl反应体系中，加入1µl 10X RecA Reaction Buffer、图中指定量的本产品(0-5μg)及5pmol ssDNA (25bp)，随后用超纯水补足至10μl，37ºC孵育30分钟进行充分结合。结合完成后，取10μl反应后产物，加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色, 10X) (GS007)混匀，使用BeyoGel™ EMSA PAGE预制胶(4%, 15孔) (GS306S)进行电泳检测。电泳结束后，在室温下使用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)染色凝胶20-30分钟，紫外灯下拍照观察实验结果。如图所示，本产品与N公司(Competitor)有相似的单链DNA结合活性。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7025S-1	Recombinant E.coli RecA Protein (2µg/µl)	100µl
D7025S-2	10X RecA Reaction Buffer	0.2ml
—	说明书	1份

产品编号	产品名称	包装
D7025M-1	Recombinant E.coli RecA Protein (2µg/µl)	500µl
D7025M-2	10X RecA Reaction Buffer	1ml
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，两年有效。

注意事项：

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.单链DNA结合实验
a.E.coli RecA蛋白为基因重组的重要蛋白，在基因重组开始时，E.coli RecA蛋白首先与单链DNA结合形成核蛋白质丝，如需检验E.coli RecA蛋白与单链DNA的结合情况，可参考如下步骤进行。
b.按照下表配制反应体系。

Reagent	Volume
Ultrapure Water	xµl
10X RecA Reaction Buffer	1µl
ssDNA	yµl
E.coli RecA	1-2µl
Total Volume	10µl

注1：建议最后添加E.coli RecA蛋白。
注2：请在冰浴上配制反应体系。
注3：如需摸索或调整E.coli RecA蛋白的使用量，可配制10 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, pH7.4 @ 25ºC储存液，并用其对E.coli RecA蛋白进行稀释后再添加。
注4：ssDNA的用量可按照E.coli RecA蛋白与ssDNA的摩尔比为25:1左右进行调整和尝试。
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
d.反应条件：37ºC孵育30分钟。
注1：保持恒温，否则会影响ssDNA与E.coli RecA蛋白的结合效率。
注2：反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
e.在反应产物中按比例加入EMSA上样缓冲液推荐使用碧云天生产的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色, 10X) (GS006)或EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色, 10X) (GS007)。
f.将反应后产物进行EMSA PAGE凝胶电泳。推荐使用碧云天生产的BeyoGel™系列EMSA PAGE预制胶(GS301S/GS302S)或EMSA PAGE凝胶配制试剂盒(GS298S)。
注：在正式电泳前，推荐在100V条件下，预电泳30分钟，随后上样，在冰浴上使用200-300V电压进行电泳，直至样品中的溴酚蓝电泳至凝胶的2/3位置处时，可停止电泳。
g.使用碧云天生产的NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)对凝胶进行染色，约20-30分钟后，即可在紫外灯下拍照观察，分析E.coli RecA蛋白与ssDNA的结合效果。
2.单链-双链DNA结合实验
a.E.coli RecA蛋白在与单链DNA结合形成复合物后，复合物结合双链DNA形成稳定的三螺旋结构，并寻找与单链DNA互补的序列，如需检验复合物与双链DNA的结合情况，可参考如下步骤进行。
b.按照下表配制反应体系(以pUC19载体为例，ssDNA设计为靶向pUC19的374bp处的HpyCH4IV酶切位点)。

Reagent	Volume
Ultrapure Water	xµl
10X RecA Reaction Buffer	4µl
ssDNA (60 mer)	0.18µg
pUC19	0.5pmol
ATP γ-S	0.3mM
E.coli RecA	2µl
Total Reaction Volume	40µl

c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
d.将混合物置于37ºC孵育10分钟以形成稳定的三螺旋结构，三螺旋体可在0.3mM ATP γ-S存在的情况下用于其他应用(如DNA链置换)。
e.三螺旋结构可阻断pUC19载体上374bp处HpyCH4IV位点的甲基化。向反应体系中添加8U SssI (含160μM SAM)，37ºC进行甲基化反应10分钟，对未保护的位点进行甲基化。
f.65ºC孵育15分钟，停止反应，破坏三螺旋结构。
g.向反应体系中加入10U HpyCH4IV，37ºC消化20分钟。
h.向反应体系中加入8μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，然后使用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。pUC19发生线性化(线性化比例超过90%)，即确定三螺旋结构形成。
3.其它用途请自行根据实验目的，查阅相关文献资料进行。
参考文献：
1.Yao Y,Li X,Chen W, et al. Front Plant Sci. 2020, 11:839.
2.Olaf Piepenburg, Colin H, WilliamsNiall A, ArmesDerek L, Stemple. Recombinase polymerase amplification. US8574846B2 [P]. 2013.
3.Del Val E, Nasser W, Abaibou H, Reverchon S. Biochem Soc Trans. 2019. 47(5):1511-1531.
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