Recombinant E.coli RecA Protein
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产品编号 D7025M
数量
¥ 1528.00
产品包装:
200μg 1mg
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碧云天生产的Recombinant E.coli RecA Protein,即重组大肠杆菌RecA蛋白,也称E.coli RecA,是碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种大肠杆菌内源性表达的对于DNA损伤修复和紫外诱导的突变过程中的遗传重组起关键作用的酶。RecA的合成是由DNA损伤导致的SOS反应诱导的。RecA具有单链DNA依赖的ATP酶活性,在同源重组反应的过程中,会形成D-loop和Holliday structure;它还具有coprotease活性,并促进LexA抑制子、lambda噬菌体抑制子和UmuD蛋白的自剪切。RecA在真核生物中的同源蛋白是Rad51和Dmc1[1]。E.coli RecA蛋白可用于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification, RPA)[2]。

体外研究所必需的表明,在ATP存在的情况下,E.coli RecA蛋白首先与单链DNA结合形成核蛋白丝,核蛋白丝与双链DNA结合形成突触丝,突触丝打开双链体并寻找同源链,之后催化互补链的交换,结合E.coli RecA蛋白的单链DNA与互补链DNA从5′→3′方向进行互补配对最终形成新的异源双链体并发生分叉迁移[3]。

用途:电镜下DNA结构的可视化,D-loop突变,利用E.coli RecA蛋白结合的探针进行DNA文库筛选,在单个指定位点进行DNA酶切,介导全长cDNA克隆的亲和捕获,同源重组机制及SOS反应研究,重组酶聚合酶扩增。

来源:纯化自携带recA基因的E.coli重组菌株。

分子量:约为38kDa。

纯度:纯度≥ 95%,且不含DNA内切酶和外切酶、不含RNA酶、不含磷酸酯酶。

浓度:2mg/ml。

酶储存溶液:10 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, pH7.4 @ 25ºC。

10X RecA Reaction Buffer:700mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 50mM DTT, pH7.6 @ 25ºC。

失活或抑制:65ºC孵育20分钟可使E.coli RecA蛋白失活。

碧云天E.coli RecA蛋白酶活性检测效果参考图1。

图1.碧云天Recombinant E.coli RecA Protein (D7025)活性鉴定结果图。在10µl反应体系中,加入1µl 10X RecA Reaction Buffer、图中指定量的本产品(0-5μg)及5pmol ssDNA (25bp),随后用超纯水补足至10μl,37ºC孵育30分钟进行充分结合。结合完成后,取10μl反应后产物,加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色, 10X) (GS007)混匀,使用BeyoGel™ EMSA PAGE预制胶(4%, 15孔) (GS306S)进行电泳检测。电泳结束后,在室温下使用NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)染色凝胶20-30分钟,紫外灯下拍照观察实验结果。如图所示,本产品与N公司(Competitor)有相似的单链DNA结合活性。实际效果会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异,图中效果仅供参考。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7025S-1 Recombinant E.coli RecA Protein (2µg/µl) 100µl
D7025S-2 10X RecA Reaction Buffer 0.2ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7025M-1 Recombinant E.coli RecA Protein (2µg/µl) 500µl
D7025M-2 10X RecA Reaction Buffer 1ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,两年有效。

注意事项:

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.单链DNA结合实验
a.E.coli RecA蛋白为基因重组的重要蛋白,在基因重组开始时,E.coli RecA蛋白首先与单链DNA结合形成核蛋白质丝,如需检验E.coli RecA蛋白与单链DNA的结合情况,可参考如下步骤进行。
b.按照下表配制反应体系。
Reagent Volume
Ultrapure Water xµl
10X RecA Reaction Buffer 1µl
ssDNA yµl
E.coli RecA 1-2µl
Total Volume 10µl
注1:建议最后添加E.coli RecA蛋白。
注2:请在冰浴上配制反应体系。
注3:如需摸索或调整E.coli RecA蛋白的使用量,可配制10 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, pH7.4 @ 25ºC储存液,并用其对E.coli RecA蛋白进行稀释后再添加。
注4:ssDNA的用量可按照E.coli RecA蛋白与ssDNA的摩尔比为25:1左右进行调整和尝试。
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
d.反应条件:37ºC孵育30分钟。
注1:保持恒温,否则会影响ssDNA与E.coli RecA蛋白的结合效率。
注2:反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
e.在反应产物中按比例加入EMSA上样缓冲液推荐使用碧云天生产的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色, 10X) (GS006)或EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色, 10X) (GS007)。
f.将反应后产物进行EMSA PAGE凝胶电泳。推荐使用碧云天生产的BeyoGel™系列EMSA PAGE预制胶(GS301S/GS302S)或EMSA PAGE凝胶配制试剂盒(GS298S)。
注:在正式电泳前,推荐在100V条件下,预电泳30分钟,随后上样,在冰浴上使用200-300V电压进行电泳,直至样品中的溴酚蓝电泳至凝胶的2/3位置处时,可停止电泳。
g.使用碧云天生产的NA-Red (EB升级换代产品, 2000X) (D0128/D0130)对凝胶进行染色,约20-30分钟后,即可在紫外灯下拍照观察,分析E.coli RecA蛋白与ssDNA的结合效果。
2.单链-双链DNA结合实验
a.E.coli RecA蛋白在与单链DNA结合形成复合物后,复合物结合双链DNA形成稳定的三螺旋结构,并寻找与单链DNA互补的序列,如需检验复合物与双链DNA的结合情况,可参考如下步骤进行。
b.按照下表配制反应体系(以pUC19载体为例,ssDNA设计为靶向pUC19的374bp处的HpyCH4IV酶切位点)。
Reagent Volume
Ultrapure Water xµl
10X RecA Reaction Buffer 4µl
ssDNA (60 mer) 0.18µg
pUC19 0.5pmol
ATP γ-S 0.3mM
E.coli RecA 2µl
Total Reaction Volume 40µl
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,随后低速离心以使粘附在管壁上的液体聚集于管底。
d.将混合物置于37ºC孵育10分钟以形成稳定的三螺旋结构,三螺旋体可在0.3mM ATP γ-S存在的情况下用于其他应用(如DNA链置换)。
e.三螺旋结构可阻断pUC19载体上374bp处HpyCH4IV位点的甲基化。向反应体系中添加8U SssI (含160μM SAM),37ºC进行甲基化反应10分钟,对未保护的位点进行甲基化。
f.65ºC孵育15分钟,停止反应,破坏三螺旋结构。
g.向反应体系中加入10U HpyCH4IV,37ºC消化20分钟。
h.向反应体系中加入8μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071),然后使用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。pUC19发生线性化(线性化比例超过90%),即确定三螺旋结构形成。
3.其它用途请自行根据实验目的,查阅相关文献资料进行。
参考文献:
1.Yao Y,Li X,Chen W, et al. Front Plant Sci. 2020, 11:839.
2.Olaf Piepenburg, Colin H, WilliamsNiall A, ArmesDerek L, Stemple. Recombinase polymerase amplification. US8574846B2 [P]. 2013.
3.Del Val E, Nasser W, Abaibou H, Reverchon S. Biochem Soc Trans. 2019. 47(5):1511-1531.
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