T4 Endonuclease V (T4 PDG)
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产品编号 D6785L
数量
¥ 1158.00
产品包装:
1kU 5kU 20kU
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碧云天生产的T4 Endonuclease V (T4 PDG),简称T4 Endo V,也称T4 pyrimidine dimer glycosylase (T4 PDG),中文名为T4核酸内切酶V,也称T4嘧啶二聚体糖基化酶,是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组内切酶。T4 Endonuclease V来源于T4噬菌体,是一种DNA损伤修复酶,具有N-糖基化酶(N-glycosylase)活性和AP裂解酶(AP-lyase)活性。T4 Endonuclease V的N-糖基化酶活性可以识别由紫外辐射等引起的顺式环丁烷嘧啶(cis-syn cyclobutane pyrimidine)二聚体(包括T^T,T^C,C^C),并且在嘧啶二聚体的5'-糖苷键处进行酶切产生一个脱嘧啶(Apyrimidinic, AP)位点;T4 Endonuclease V的AP裂解酶活性通过β消除作用(β-elimination)切除AP位点,且产生一个具有3'-α,β-不饱和醛和5'-磷酸的碱基缺口(Gap) [1,2]。

本产品识别并切除双链DNA上受损碱基的原理请参考图1。

图1.碧云天T4 Endonuclease V (D6785)识别并切除双链DNA上受损碱基的示意图。T4 Endonuclease V在其N-糖基化酶活性作用下识别并切除双链DNA中由紫外辐射等引起的顺式环丁烷嘧啶二聚体(包括T^T,T^C,C^C),产生一个AP位点;随后其AP裂解酶活性通过β消除作用切除AP位点,且产生一个具有3'-α,β-不饱和醛和5'磷酸的碱基缺口(Gap)。

碧云天生产的T4 Endonuclease V催化酶切含AP位点双链DNA的效果请参考图2。

图2.碧云天生产的T4 Endonuclease V (D6785)和国外N公司的同类产品(Competitor)催化切除含AP位点双链DNA效果图。在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或N公司的T4 Endonuclease V,37ºC孵育30分钟进行损伤位点切除反应,反应完毕后立即放至冰上,并加入DNA/RNA Loading Buffer (2X, for Denaturing PAGE) (R0212 ),随后用BeyoGel™ TBE-Urea PAGE预制胶(15%) (R0243/R0244)进行电泳分析,最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示,本产品与N公司的产品相比,具有类似的催化效果。反应体系(20μl):100mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,25mM Na2HPO4,pH 7.2 @ 25ºC,20pmol含AP位点的双链DNA以及不同浓度的T4 Endonuclease V。含AP位点的双链DNA制备方法:将含dU碱基的 31nt单链DNA和正常的与其互补的27nt单链DNA按照Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251)说明书中的使用方法通过梯度降温退火形成双链DNA;随后使用Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) (D7360)、Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium) (D7362)或Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Cod) (D7364)催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解,从而释放游离尿嘧啶产生含AP位点的双链DNA,最终可以被T4 Endonuclease V所识别和酶切。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

用途:可用于DNA损伤研究;单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis)。

来源:由大肠杆菌表达,经纯化而获得。

活性单位定义:One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the conversion of 0.5µg of UV irradiated supercoiled pUC19 DNA to > 95% nicked plasmid in a total reaction volume of 20µl in 30 minutes at 37ºC. Nicking is assessed by agarose gel electrophoresis. Irradiated plasmid contains an average of 3-5 pyrimidine dimers.

纯度:大于95%,无其自身之外的DNA内切酶活性和外切酶活性,无RNA酶活性。

酶储存溶液:10mM Tris-HCl (pH7.4 @ 25ºC), 250mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% (v/v) Glycerol,0.15% Triton X-100.

失活或抑制:65ºC 10分钟。

10X T4 Endonuclease V Buffer: 250mM Na2HPO4 (pH7.2 @ 25ºC), 1M NaCl, 10mM EDTA,10mM DTT.

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D6785S-1 T4 Endonuclease V (10U/µl) 100µl
D6785S-2 10X T4 Endonuclease V Buffer 0.4ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D6785M-1 T4 Endonuclease V (10U/µl) 500µl
D6785M-2 10X T4 Endonuclease V Buffer 2ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D6785L-1 T4 Endonuclease V (10U/µl) 2ml
D6785L-2 10X T4 Endonuclease V Buffer 8ml
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,至少两年有效。

注意事项:

本产品中在使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20ºC保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.使用T4 Endonuclease V切除双链DNA中的AP位点。
a.双链DNA的制备:使用碧云天Annealing Buffer for DNA Oligos (5X) (D0251)使一种单链DNA (中间含有一个或多个脱氧尿嘧啶碱基dU)和其互补的单链DNA (中间不含有脱氧尿嘧啶碱基)退火形成双链DNA。
b.含AP位点双链DNA的制备:使用碧云天Uracil-DNA Glycosylase (E.coli) (D7360)、Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile, Bacterium) (D7362)或Uracil-DNA Glycosylase (Heat-labile,Cod) (D7364)处理上一步骤中退火的双链DNA,生成含有AP位点的双链DNA。
c.切除双链DNA中的AP位点:
(a)参考下表在冰浴中配制反应体系。
Component Volume
Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) 15µl
10X T4 Endonuclease V Buffer 2µl
dsDNA with AP site (10µM/µl) 2µl
T4 Endonuclease V (10U/µl) 1µl
注:请把除T4 Endonuclease V以外的组分充分混匀后再加入T4 Endonuclease V,加入T4 Endonuclease V后可以用移液器吹打混匀。如果待酶切DNA量较大,可以适当延长酶切时间或按比例放大酶切体系。
(b)反应条件:37ºC,30分钟。
(c)终止反应:65ºC加热10分钟,或冰浴孵育1-2分钟并加入DNA/RNA Loading Buffer (2X, for Denaturing PAGE) (R0212)。
2.其它应用请参考相关文献进行。
参考文献:
1.Dizdaroglu M, Laval J, Boiteux S. Biochemistry. 1993. 32(45):12105-12111.
2.Hatahet Z, Kow YW, Purmal AA, Cunningham RP, Wallace SS. J Biol Chem. 1994. 269(29):18814-18820.
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