pAc5.1/V5-His A (S2果蝇细胞组成型表达质粒)
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pAc5.1/V5-His A (S2果蝇细胞组成型表达质粒)是碧云天自行研发生产的S2果蝇细胞(Drosophila Schneider 2)组成型表达质粒。本质粒与pAc5.1/V5-His B (D4755)和pAc5.1/V5-His C (D4759)的区别在于多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)的阅读框不同,便于重组蛋白与C端V5标签和His标签的融合表达。碧云天同时提供相应的阳性对照质粒pAc5.1/V5-His/lacZ (D4748)。

S2果蝇细胞,也称S2果蝇胚胎细胞、S2细胞、S2昆虫细胞,源自20-24小时龄的黑腹果蝇胚胎晚期的原代细胞培养物[1]。S2果蝇细胞在培养皿或培养瓶中为半贴壁细胞,在摇瓶中为悬浮细胞,无需CO2,可在室温(26-28ºC)培养,生长速度快,细胞密度高,可通过瞬时转染或稳定细胞系表达外源重组蛋白,兼容无血清培养基,已广泛用于大规模重组蛋白的生产[2]。

本质粒采用的Ac5启动子(The Drosophila Actin 5C promoter)可以高效启动重组蛋白在果蝇S2果蝇细胞组成型表达,使用组成型Ac5启动子与诱导型MT启动子(The Drosophila metallothionein promoter)的重组蛋白表达量相当[3]。碧云天同时提供诱导型MT启动子系列产品:pMT/V5-His A (D4716)、pMT/V5-His B (D4719)、pMT/V5-His C (D4721)。

本质粒不带有分泌信号肽(Secretion signal peptide),如果插入基因不带有原生分泌信号肽,重组蛋白将在S2果蝇细胞内表达。如果需要重组蛋白分泌到培养基上清中,建议购买含有BiP分泌信号肽的质粒:pMT/BiP/V5-His A (D4727)、pMT/BiP/V5-His B (D4732)或pMT/BiP/V5-His C (D4735)。

本质粒的克隆插入基因应包含一个带有ATG启动密码子的Kozak翻译启动序列((G/A)NNATGG),以便正确启动重组蛋白的表达。

本质粒可与pCoPuro (D4701)、pCoBlast (D4705)或pCoHygro (D4708)共转染至S2果蝇细胞,后续通过嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride) (ST551)、灭瘟素S (Blasticidin S HCl) (ST018)或潮霉素B (Hygromycin B) (ST1389)筛选得到含有目的基因的诱导型S2果蝇稳定细胞株。建议在筛选稳定细胞株之前,先通过瞬时转染测试重组蛋白能否表达。

本质粒在多克隆位点之后含有V5标签(GKPIPNPLLGLDST)和His标签(HHHHHH),便于重组蛋白的检测和纯化。

本质粒具有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性,可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌。

pAc5.1/V5-His A质粒的图谱如下:

pAc5.1/V5-His A质粒的主要信息如下:

Base pairs 5375
Ac5 promoter 56-2568
MCS (Multiple Cloning Site) 2579-2659
V5 Tag 2660-2701
6X His Tag 2711-2728
SV40 poly (A) signal 2801-2935
ori 3557-4145
Ampicillin 4316-5176
Ampicillin promoter 5177-5281

pAc5.1/V5-His A的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D4751 pAc5.1/V5-His A (S2果蝇细胞组成型表达质粒).pdf

pAc5.1/V5-His A中没有的酶切位点包括:

AarI AbsI AccIII AcvI AdeI AjiI AjuI
AleI AloI Aor13HI AscI AspI AspA2I AsuNHI
AvrII AxyI BaeI BarI BbrPI BlnI BmgBI
BmtI BplI BsaAI BsaXI Bse21I BseAI BsePI
Bsp13I BspEI BspOI BspQI BssHII BssNAI Bst1107I
BstBAI BstEII BstENI BstPI BstSNI BstZ17I Bsu36I
BtrI Cfr42I CpoI CsiI CspI CspCI DraIII
Eco72I Eco81I Eco91I Eco105I EcoNI EcoO65I FalI
FseI FspAI HindIII I-CeuI I-PpoI I-SceI KflI
Kpn2I KspI LguI MabI MauBI MreI MroI
NheI Nt.BspQI OliI PacI PalAI PasI PauI
PciSI PflFI PfoI PI-PspI PI-SceI PmaCI PmlI
Ppu21I PspCI PspEI PsyI PteI RigI RsrII
Rsr2I SacII SanDI SapI SbfI SdaI SexAI
SfiI Sfr303I SgrAI SgrBI SgrDI SgsI SmiI
SnaBI SrfI Sse8387I SstII SwaI Tth111I XagI
XcmI XmaJI

pAc5.1/V5-His A中的单酶切位点包括:

Acc65I AflII AgeI AhdI ApaI AsiSI BamHI
BbvCI BfuAI BglII BlpI BsiWI BspDI BspMI
BstBI BtgI ClaI DrdI Eco53kI EcoRI EcoRV
HpaI KasI KpnI MluI NarI NcoI NdeI
NmeAIII NotI NsiI PaeR7I PflMI PluTI PmeI
PpuMI PshAI PspOMI PspXI SacI SalI ScaI
SfoI SmaI SphI StuI StyI TspMI XbaI
XhoI XmaI

pAc5.1/V5-His A质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

Ac5 Forward (2525-2544): 5'-ACACAAAGCCGCTCCATCAG-3'

BGH Reverse (2751-2768): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAG-3'

pAc5.1/V5-His A的全序列信息: D4751 pAc5.1/V5-His A (S2果蝇细胞组成型表达质粒) 全序列.txt

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D4751-1µg pAc5.1/V5-His A (S2果蝇细胞组成型表达质粒) 1µg
D4751-100µg pAc5.1/V5-His A (S2果蝇细胞组成型表达质粒) 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2. 100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
参考文献:
1. Schneider I. J Embryol Exp Morphol. 1972. 27(2):353-65.
2. Moraes AM, Jorge SA, Astray RM, Suazo CA, Calderón Riquelme CE, et al. Biotechnol Adv. 2012. 30(3):613-28.
3. Kovach MJ, Carlson JO, Beaty BJ. Insect Mol Biol. 1992. 1(1):37-43.
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