pMT/V5-His B (S2果蝇细胞诱导型表达质粒)
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pMT/V5-His B (S2果蝇细胞诱导型表达质粒)是碧云天自行研发生产的一种在S2果蝇细胞(Drosophila Schneider 2)诱导型表达质粒。本质粒与pMT/V5-His A (D4716)和pMT/V5-His C (D4721)的区别在于多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)的阅读框不同,便于重组蛋白与C端V5标签和His标签的融合表达。碧云天同时提供相应的阳性对照质粒pMT/V5-His/lacZ (D4712)。

S2果蝇细胞,也称S2果蝇胚胎细胞、S2细胞、S2昆虫细胞,源自20-24小时龄的黑腹果蝇胚胎晚期的原代细胞培养物[1]。S2果蝇细胞在培养皿或培养瓶中为半贴壁细胞,在摇瓶中为悬浮细胞,无需CO2,可在室温(26-28ºC)培养,生长速度快,细胞密度高,可通过瞬时转染或稳定细胞系表达外源重组蛋白,兼容无血清培养基,已广泛用于大规模重组蛋白的生产[2]。

本质粒采用的MT启动子(The Drosophila metallothionein promoter)受重金属离子的(Zn2+, Cd2+)的严格调控,因此S2果蝇细胞可通过加入CuSO4或CdCl2瞬时高效启动外源基因表达。建议使用500-1000μM CuSO4或10μM CdCl2诱导外源基因表达。CuSO4细胞毒性低于CdCl2,CdCl2启动效率高于CuSO4 [3]。碧云天同时提供组成型Ac5启动子系列产品:pAc5.1/V5-His A (D4751)、pAc5.1/V5-His B (D4755)、pAc5.1/V5-His C (D4759)。

本质粒不带有分泌信号肽(Secretion signal peptide),如果插入基因不带有原生分泌信号肽,重组蛋白将在S2果蝇细胞内表达。如果需要重组蛋白分泌到培养基上清中,建议购买含有BiP分泌信号肽的质粒:pMT/BiP/V5-His A (D4727)、pMT/BiP/V5-His B (D4732)或pMT/BiP/V5-His C (D4735)。

本质粒的克隆插入基因应包含一个带有ATG启动密码子的Kozak翻译启动序列((G/A)NNATGG),以便正确启动重组蛋白的表达。

本质粒可与pCoPuro (D4701)、pCoBlast (D4705)或pCoHygro (D4708)共转染至S2果蝇细胞,后续通过嘌呤霉素(Puromycin Dihydrochloride) (ST551)、灭瘟素S (Blasticidin S HCl) (ST018)或潮霉素B (Hygromycin B) (ST1389)筛选得到含有目的基因的诱导型S2果蝇稳定细胞株。建议在筛选稳定细胞株之前,先通过瞬时转染测试重组蛋白能否表达。

本质粒在多克隆位点之后含有V5标签(GKPIPNPLLGLDST)和His标签(HHHHHH),便于重组蛋白的检测和纯化。

本质粒具有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性,可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌。

pMT/V5-His B质粒的图谱如下:

pMT/V5-His B质粒的主要信息如下:

Base pairs 3542
M13 Forward 379-395
MT promoter 411-833
MCS (Multiple Cloning Site) 849-933
V5 Tag 934-975
6X His Tag 985-1002
SV40 poly (A) signal 1044-1178
M13 Reverse 1322-1338
lac operator 1346-1362
lac promoter 1370-1400
CAP binding site 1415-1436
ori 1724-2312
Ampicillin 2483-3343
Ampicillin promoter 3344-3448

pMT/V5-His B的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D4719 pMT/V5-His B (S2果蝇细胞诱导型表达质粒).pdf

pMT/V5-His B中没有的酶切位点包括:

AarI AatI AbsI AccIII AccB7I AcvI AdeI
AfeI AflII AjuI AleI AlfI AloI Aor13HI
Aor51HI AscI AsiSI AspI AspA2I AsuNHI AvrII
AxyI BamHI BanIII BarI BbrPI BbsI BbvCI
BfrI BglII BlnI BlpI BmtI BoxI BpiI
BplI Bpu10I Bpu1102I BpuAI Bsa29I BsaAI Bse21I
BseAI BseCI BsePI BshVI BsiWI Bsp13I Bsp19I
Bsp68I Bsp1407I Bsp1720I BspDI BspEI BspOI BspTI
BspXI BsrGI BssHII BssNAI BssT1I Bst98I Bst1107I
BstAFI BstAUI BstBAI BstEII BstENI BstPI BstPAI
BstSNI BstV2I BstZ17I Bsu15I Bsu36I BsuTUI BtgZI
BtuMI CelII Cfr9I ClaI CpoI CsiI CspI
CspCI DraIII Ecl136II Eco47III Eco53kI Eco72I Eco81I
Eco91I Eco105I Eco130I Eco147I EcoICRI EcoNI EcoO65I
EcoT14I EcoT22I ErhI FalI FseI FspAI I-CeuI
I-PpoI I-SceI KflI Kpn2I MabI MauBI Mph1103I
MreI MroI MspCI Nb.BbvCI Nb.Bpu10I NcoI NheI
NruI NsiI Nt.BbvCI Nt.Bpu10I OliI PacI PalAI
PasI PauI PceI Pfl23II PflFI PflMI PI-PspI
PI-SceI PmaCI PmlI Ppu21I PpuMI PshAI Psp5II
Psp124BI PspCI PspEI PspLI PspPPI PsrI PsyI
PteI RgaI RigI RruI RsrII Rsr2I SacI
SanDI SexAI SfaAI SfiI SgfI SgrAI SgrDI
SgsI SmaI SmiI SnaBI SrfI SseBI SspBI
SstI StuI StyI SwaI TspMI Tth111I Van91I
Vha464I XagI XcmI XmaI XmaCI XmaJI Zsp2I

pMT/V5-His B中的单酶切位点包括:

AatII AccI Acc65I AgeI AhdI AlwNI ApaI
AvaI BanII BfuAI BmeT110I BmgBI BpmI BseRI
BseYI BsgI BsmFI BsoBI BspMI BspQI BstAPI
BstBI BtgI EcoRI EcoRV FaqI HpaI KasI
KpnI MfeI MluI MscI NarI NmeAIII NotI
PaeR7I PciI PfoI PluTI PmeI PsiI PspFI
PspOMI PspXI SacII SalI SapI SbfI ScaI
SfoI SpeI SspI XhoI ZraI

pMT/V5-His B质粒中推荐使用的测序引物序列如下:

M13 Forward (379-395): 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'

M13 Reverse ((1322-1338): 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'

pMT/V5-His B的全序列信息: D4719 pMT/V5-His B (S2果蝇细胞诱导型表达质粒) 全序列.txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D4719-1µg pMT/V5-His B (S2果蝇细胞诱导型表达质粒) 1µg
D4719-100µg pMT/V5-His B (S2果蝇细胞诱导型表达质粒) 100µg
说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
参考文献:
1. Schneider I. J Embryol Exp Morphol. 1972. 27(2):353-65.
2. Moraes AM, Jorge SA, Astray RM, Suazo CA, Calderón Riquelme CE, et al. Biotechnol Adv. 2012. 30(3):613-28.
3. Kovach MJ, Carlson JO, Beaty BJ. Insect Mol Biol. 1992. 1(1):37-43.
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