pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)是碧云天自行研发生产的RaPID质粒对中RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)的阳性对照质粒。EDEN15是一段富含UG的RNA序列，可以高效结合分子量大小约50kDa的CELF1 (CUGBP Elav-Like Family Member 1)。
RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric)，利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记，后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图1)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence)：包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region)，与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。
图1. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图[1]。
RaPID具有如下优点：①活细胞内标记：适合空间和时间上对细胞内究RNA-蛋白质间的相互作用动态过程的研究，如亚细胞定位、翻译后修饰或蛋白质浓度变化导致的影响，还可以提供动力学数据。②不需要交联：RaPID无需交联，传统的甲醛或紫外光照射交联不仅对细胞影响较大，而且交联效率较低。③敏感性高：RaPID可以有效识别RNA与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。④所需细胞数目少：相比于常见的ChIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification)技术需要1-5×108个细胞，RaPID只需要2-5×106个细胞。⑤适用RNA种类多：对RNA结构没有限定，具有二级结构和无特定结构均可，而且可以研究<50nt的小RNA片段。⑥反应速度快：加入生物素后，miniTurbo最快10分钟就可以完成对RNA结合蛋白的生物素标记。
RaPID包括2个质粒：RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (D3039)，即RaPID protein；和RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)，即RNA component。
pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (D3039)可在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)：λN肽段(MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN, 22aa)能够将miniTurbo定位结合到RNA诱饵片段旁的BoxB茎环结构上；核外运信号(Nuclear Export Signal, NES) 辅助miniTurbo进入细胞质中；miniTurbo是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶(BirA)人工改造获得的新型生物素连接酶，在ATP存在的条件下，miniTurbo可以高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记，从而对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记。
pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (D3040)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体，RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间，其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。
本质粒含有CMV启动子，可以高效启动EDEN15 RNA片段在细胞中的表达；可通过荧光显微镜观察细胞表达EGFP绿色荧光的情况，以确定在EGFP的3' UTR端EDEN15 RNA片段的表达情况；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 235-818 |
| EGFP | 907-1626 |
| 3X λ boxB right | 1648-1706 |
| EDEN15 | 1713-1757 |
| 3X λ boxB right | 1765-1823 |
| BGH poly(A) signal | 1884-2108 |
| f1 ori | 2154-2582 |
| SV40 promoter | 2596-2925 |
| Neomycin resistance gene | 2992-3786 |
| SV40 poly(A) signal | 3960-4081 |
| lac operator | 4154-4170 |
| CAP binding site | 4223-4244 |
| ori | 4532-5117 |
| Ampicillin resistance gene | 5288-6148 |
| Ampicillin promoter | 6149-6253 |
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB质粒(6284bp)的图谱如下：
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB表达基因的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D3042 pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒).pdf
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | Acc65I | AccB7I | AcvI | AfeI |
| AflII | AgeI | AjiI | AjuI | Aor13HI | Aor51HI | AscI |
| AsiGI | AsiSI | Asp718I | AxyI | BamHI | BanIII | BarI |
| BbrPI | BbvCI | BfrI | BlpI | BmgBI | BoxI | Bpu1102I |
| Bsa29I | Bse21I | BseAI | BseCI | BshVI | BshTI | BsiWI |
| Bsp13I | Bsp1720I | BspDI | BspEI | BspTI | BspXI | Bst98I |
| BstAFI | BstEII | BstHPI | BstPI | BstPAI | BstXI | Bsu15I |
| Bsu36I | BsuTUI | BtrI | CciNI | CelII | Cfr42I | ClaI |
| CspAI | DraII | Eco32I | Eco47III | Eco72I | Eco81I | Eco91I |
| EcoO65I | EcoO109I | EcoRV | FseI | FspAI | HpaI | I-CeuI |
| I-PpoI | I-SceI | KflI | KpnI | Kpn2I | KspI | KspAI |
| MauBI | MreI | MroI | MspCI | Nb.BbvCI | NotI | Nt.BbvCI |
| PacI | PalAI | PaqCI | PasI | Pfl23II | PflMI | PI-PspI |
| PI-SceI | PinAI | PmaCI | PmlI | PpuMI | PshAI | Psp5II |
| PspCI | PspEI | PspLI | PspPPI | PspXI | PsrI | RgaI |
| RigI | SacII | SanDI | SbfI | SdaI | SfaAI | SfiI |
| Sfr303I | SgfI | SgrAI | SgrBI | SgsI | SmiI | SrfI |
| Sse8387I | SstII | SwaI | TstI | Van91I | Vha464I | XbaI |
| XcmI |
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB中的单酶切位点包括：
| AhdI | ApaI | AvrII | BbsI | BglII | BmtI | BsaBI |
| BsmI | BsrGI | BssHII | BstBI | BstZ17I | CsiI | DraIII |
| EagI | Eco53kI | KasI | MfeI | MluI | MscI | NarI |
| NdeI | NheI | NruI | PaeR7I | PciI | PflFI | PluTI |
| PmeI | PspOMI | PstI | PvuI | RsrII | SacI | ScaI |
| SexAI | SfoI | SgrDI | SmaI | SnaBI | SpeI | SspI |
| StuI | TspMI | Tth111I | XhoI | XmaI |
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
BGH-R (1895-1878): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'
pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB的全序列信息:D3042 pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)-全长序列.txt。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D3042-1µg | pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB | 1µg |
| D3042-100µg | pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB | 100µg |
| — | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
