pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达RNA诱饵片段的载体，RNA诱饵片段被2个λ噬菌体(Bacteriophage lambda)的BoxB RNA茎环结构夹在中间，其中BoxB茎环结构与λN肽段具有极高的亲和力。

RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)是在活细胞内(in Vivo)以RNA为中心(RNA-centric)，利用生物素连接酶对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记，后续通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)或Western鉴定RNA-蛋白质间相互作用的技术(图1)。RaPID在筛选和鉴定活细胞内非编码RNA序列(Noncoding RNA sequence)：包括长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)、小核仁RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA)和非翻译mRNA区域(Untranslated mRNA region)，与RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。

图1. 碧云天RaPID (RNA-Protein Interaction Detection)生物素标记质粒的工作原理图。

RaPID具有如下优点：①活细胞内标记：适合空间和时间上对细胞内RNA-蛋白质间的相互作用动态过程的研究，如亚细胞定位、翻译后修饰或蛋白质浓度变化导致的影响，还可以提供动力学数据。②不需要交联：RaPID无需交联，传统的甲醛或紫外光照射交联不仅对细胞影响较大，而且交联效率较低。③敏感性高：RaPID可以有效识别RNA与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。④所需细胞数目少：相比于常见的ChIRP (Chromatin Isolation by RNA Purification)技术需要1-5×10⁸个细胞，RaPID只需要2-5×10⁶个细胞。⑤适用RNA种类多：对RNA结构没有限定，具有二级结构和无特定结构均可，而且可以研究<50nt的小RNA片段。⑥反应速度快：加入生物素后，miniTurbo最快10分钟就可以完成对RNA结合蛋白的生物素标记。

RaPID包括2个质粒：RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (本产品)，即RNA component；和RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (D3039)，即RaPID protein。

pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (D3039)可在哺乳动物细胞中融合表达λN肽段、核外运信号和生物素连接酶(miniTurbo)：λN肽段(MNARTRRRERRAEKQAQWKAAN, 22aa)能够将miniTurbo定位结合到RNA诱饵片段旁的BoxB茎环结构上；核外运信号(Nuclear Export Signal, NES) 辅助miniTurbo进入细胞质中；miniTurbo是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E. coli 生物素连接酶(BirA)人工改造获得的新型生物素连接酶，在ATP存在的条件下，miniTurbo可以高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记，从而对与RNA诱饵片段相互作用的蛋白质进行生物素标记。

本质粒含有CMV启动子，可以高效启动RNA诱饵片段在细胞中的表达；可通过荧光显微镜观察细胞表达EGFP绿色荧光的情况，以确定在EGFP的3' UTR端诱饵RNA诱饵片段的表达情况；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	235-818
EGFP	907-1626
3X λ boxB right	1648-1706
Bait RNA insert site	1720-2114
3X λ boxB right	2129-2187
BGH poly(A) signal	2248-2472
f1 ori	2518-2946
SV40 promoter	2960-3289
Neomycin resistance gene	3356-4150
SV40 poly(A) signal	4324-4445
lac operator	4518-4534
CAP binding site	4587-4608
ori	4896-5481
Ampicillin resistance gene	5652-6512
Ampicillin promoter	6513-6617

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB质粒(6648bp)的图谱如下：

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB表达基因的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D3040 pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒).pdf。

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	Acc65I	AccB7I	AcvI	AfeI
AflII	AgeI	AjiI	AjuI	Aor13HI	Aor51HI	AscI
AsiGI	AsiSI	Asp718I	AxyI	BamHI	BanIII	BarI
BbrPI	BbvCI	BfrI	BlpI	BmgBI	BoxI	Bpu1102I
Bsa29I	Bse21I	BseAI	BseCI	BshVI	BshTI	BsiWI
Bsp13I	Bsp1720I	BspDI	BspEI	BspTI	BspXI	Bst98I
BstAFI	BstEII	BstHPI	BstPI	BstPAI	BstXI	Bsu15I
Bsu36I	BsuTUI	BtrI	CciNI	CelII	Cfr42I	ClaI
CspAI	DraII	Eco32I	Eco47III	Eco72I	Eco81I	Eco91I
EcoO65I	EcoO109I	EcoRV	FseI	FspAI	HpaI	I-CeuI
I-PpoI	I-SceI	KflI	KpnI	Kpn2I	KspI	KspAI
MauBI	MreI	MroI	MspCI	Nb.BbvCI	NotI	Nt.BbvCI
PacI	PalAI	PaqCI	PasI	Pfl23II	PflMI	PI-PspI
PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmlI	PpuMI	PshAI	Psp5II
PspCI	PspEI	PspLI	PspPPI	PspXI	PsrI	RgaI
RigI	SacII	SanDI	SbfI	SdaI	SfaAI	SfiI
Sfr303I	SgfI	SgrAI	SgrBI	SgsI	SmiI	SrfI
Sse8387I	SstII	SwaI	TstI	Van91I	Vha464I	XbaI
XcmI

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB中的单酶切位点包括：

AhdI	ApaI	AvrII	BbsI	BglII	BmtI	BsaBI
BsmI	BsrGI	BssHII	BstBI	BstZ17I	CsiI	DraIII
EagI	Eco53kI	KasI	MfeI	MluI	MscI	NarI
NdeI	NheI	NruI	PaeR7I	PciI	PflFI	PluTI
PmeI	PspOMI	PstI	PvuI	RsrII	SacI	ScaI
SexAI	SfoI	SgrDI	SmaI	SnaBI	SpeI	StuI
TspMI	Tth111I	XhoI	XmaI

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (2259-2242): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB的全序列信息:D3040 pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒).txt。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D3040-1µg	pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB	1µg
D3040-100µg	pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB	100µg
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.首次使用1µg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.25µg/µl，共400µl。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.构建RNA诱饵载体。
a.设计RNA诱饵片段。此处以pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒) (D3042)的EDEN15片段设计为例：
F：5'-GCTTTGTTTGTTTGTTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTGTTTGTTTGTTTGT-3'
R：5'-AGCTACAAACAAACAAACAACAAACAAACAAACAACAAACAAACAAACA-3'
注：下划线部分为与BsmBI酶切RNA诱饵载体产生的4个碱基突出末端的互补序列，必须保留；阴影部分为EDEN15片段序列，设计时可替换为相应的RNA诱饵片段序列。
b.正、反向引物通过退火获得双链RNA诱饵片段。 此处以EDEN15引物退火获得的双链片段为例：
5'-GCTTTGTTTGTTTGTTTGTTGTTTGTTTGTTTGTTGTTTGTTTGTTTGT-3'
       3'-ACAAACAAACAAACAACAAACAAACAAACAACAAACAAACAAACATCGA-5'
c.通过IIS型限制性内切酶BsmBI对RNA诱饵载体(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)进行酶切，然后通过T4 DNA 连接酶将双链RNA诱饵片段连接到RNA诱饵载体的2组BoxB茎环结构之间。
注1：BsmBI的识别位点为CGTCTC (N1/N5)，其中CGTCTC是识别和结合位点，而N1/N5表示切割位点位于正义链的第1个碱基后(N1)，反义链的第5个碱基后(N5)。载体经BsmBI酶切后两端分别产生4个碱基的突出末端，可以与RNA诱饵片段两端序列发生互补。
注2：因为BsmBI的切割位点在识别序列外部，所以载体经BsmBI酶切后及最终的连接产物都不再含有BsmBI识别位点，不能进一步发生酶切，所以BsmBI对RNA诱饵载体的酶切和T4 DNA 连接酶对RNA诱饵片段与RNA诱饵载体的连接的反应可以同步进行，也可分2步先后进行。
4.RNA诱饵载体与RaPID生物素连接酶载体质粒共转染细胞。
a.在转染前一天将适量细胞(具体的细胞数量根据细胞类型、大小和细胞生长速度等确定)接种到6孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-80%。
b.使用合适的转染试剂例如Lipo8000™或Lipo6000™将RaPID生物素连接酶载体(pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag) (D3039) 分别与插入有RNA诱饵片段的载体、阴性对照质粒(pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB) (D3040)和阳性对照质粒(pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB) (D3042)共转染到细胞中。
注：RaPID生物素连接酶载体与RNA诱饵载体的使用比例，建议按照1:5-10进行摸索。
c.在转染12-48小时后，吸尽培养液，更换为含有0.05-500μM的生物素的完全培养液(图2, 4-6孔)或不含有生物素的完全培养液(图2, 1-3孔)，继续培养10分钟-18小时。
注：加入生物素的终浓度和后培养时间可根据实验目的进行调整。一般情况下，miniTurboID在生物素终浓度为500μM的条件下，10-60分钟就可以有效标记相互作用的蛋白，但还是建议在0.05-500μM和10分钟-18小时范围内设置梯度，以寻找最适合的生物素使用浓度和标记时间。
d.可通过荧光显微镜观察细胞表达EGFP绿色荧光的情况，以确定诱饵RNA诱饵片段的表达情况。
e.去除培养液，用预冷的PBS洗涤细胞2次，去除PBS，尽量确保没有液体残留。

图2. 碧云天pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒)推荐的使用流程图。

5.细胞裂解。
a.选择合适的裂解液，用于制备细胞裂解液。推荐使用Western及IP细胞裂解液用于细胞(P0013)。如有必要，也可以使用RIPA裂解液(P0013B/P0013C/P0013D)用于样品的制备。如果使用自行配制的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。
b.具体的细胞裂解液的制备步骤请参考相应裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清置于冰上或4℃存放，随后即可用于免疫沉淀。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作，但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80℃冻存。
6.免疫印迹法(Immunoblot)。
免疫印迹法检测λN-NES-miniTurbo-Flag蛋白的表达和被生物素标记的RNA结合蛋白。具体实验操作方法可参照碧云天网站的Western实验步骤：https://www.beyotime.com/support/western.htm
7.诱饵RNA的qPCR定量(选做)。
在RNA诱饵载体中BoxB-RNAmotif-BoxB在EGFP的3' UTR端，因此可以通过如下引物对诱饵RNA的拷贝数进行定量。
EGFP-F: 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTCAA-3'
EGFP-R: 5'-AAGTCGATGCCCTTCAGCTC-3'
8.免疫沉淀(Pull Down)生物素标记蛋白。
推荐使用BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠) (P2151)，具体的免疫沉淀步骤请参考链霉亲和素磁珠的使用说明。
9.质谱(Mass Spectrometry)鉴定。
样品SDS-PAGE电泳后对凝胶进行考染或银染，切割感兴趣的目的条带进行质谱检测；也可以通过二维电泳后寻找差异点进行质谱分析；或者直接进行基于质谱的蛋白质组分析。
参考文献：
1.Ramanathan M, Majzoub K, Rao DS, Neela PH, Zarnegar BJ, et al. Nat Methods. 2018. 15(3):207-212.
2.Ramanathan M, Porter DF, Khavari PA. Nat Methods. 2019. 16(3):225-234.
3.Branon TC, Bosch JA, Sanchez AD, Udeshi ND, Svinkina T, et al. Nat Biotechnol. 2018. 36(9):880-887.
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产品编号	产品名称	包装
D3021-1µg	pCMV-N-Flag-BioID2 (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3021-100µg	pCMV-N-Flag-BioID2 (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
D3023-1µg	pCMV-C-BioID2-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3023-100µg	pCMV-C-BioID2-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
D3025-1µg	pCMV-BioID2-Flag (阴性对照质粒)	1µg
D3025-100µg	pCMV-BioID2-Flag (阴性对照质粒)	100µg
D3027-1µg	pCMV-N-Flag-AirID (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3027-100µg	pCMV-N-Flag-AirID (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
D3029-1µg	pCMV-C-AirID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3029-100µg	pCMV-C-AirID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
D3030-1µg	pCMV-AirID-Flag (阴性对照质粒)	1µg
D3030-100µg	pCMV-AirID-Flag (阴性对照质粒)	100µg
D3034-1µg	pCMV-N-Flag-miniTurboID (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3034-100µg	pCMV-N-Flag-miniTurboID (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
D3035-1µg	pCMV-C-miniTurboID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3035-100µg	pCMV-C-miniTurboID-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
D3037-1µg	pCMV-miniTurboID-Flag (阴性对照质粒)	1µg
D3037-100µg	pCMV-miniTurboID-Flag (阴性对照质粒)	100µg
D3039-1µg	pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)	1µg
D3039-100µg	pCMV-λN-NES-miniTurbo-Flag (RaPID质粒)	100µg
D3040-1µg	pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒)	1µg
D3040-100µg	pCMV-EGFP-BoxB-RNAmotif-BoxB (RaPID质粒)	100µg
D3042-1µg	pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)	1µg
D3042-100µg	pCMV-EGFP-BoxB-EDEN15-BoxB (RaPID阳性对照质粒)	100µg
D3044-1µg	pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒)	1µg
D3044-100µg	pCMV-N-NES-Flag-APEX2 (邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
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D3047-100µg	pCMV-N-mito-Flag-APEX2 (线粒体邻近蛋白生物素标记质粒)	100µg
P2151-200μl	BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠)	200μl
P2151-1ml	BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠)	1ml
P2151-5ml	BeyoMag™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠)	5ml