pCMV-miniTurboID-Flag (阴性对照质粒)是碧云天自行研发生产的邻近蛋白生物素标记质粒pCMV-N-Flag-miniTurboID (D3034)和pCMV-C-miniTurboID-Flag (D3035)的阴性对照质粒。邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定生物体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。
图1. 碧云天邻近蛋白生物素标记质粒的工作原理图。
邻近依赖的生物素标记鉴定(Proximity-dependent biotin identification, BioID)技术是基于来源于E.coli生物素连接酶(Biotin ligase, BirA)的R118G突变体BirA*。BirA可在ATP存在的条件下，高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，并特异性地将生物素连接到Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的赖氨酸残基上，从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记；但由于来源于大肠杆菌的BirA*发生R118G突变，其活化的生物素酰-5'腺苷酸不再特异性修饰Avi标签的赖氨酸残基，而是可以对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记。
BioID具有如下优点：①适用范围广：BioID融合蛋白可以在大部分细胞中表达，除了直接相互作用的蛋白，一定范围内相邻近的蛋白也会被生物素标记，便于研究天然情况下目标蛋白与周围蛋白的相互作用；适合空间和时间上细胞的动态过程的研究，还可以提供动力学数据。②敏感性高：BioID可以有效识别无法通过酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)或亲和纯化检测的体内蛋白与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。③克服溶解度难题：BioID特别适合研究在酵母双杂交中可溶性差或较难纯化的蛋白。④标记的蛋白易纯化、背景低：蛋白经BioID标记生物素后与Streptavidin磁珠或凝胶结合紧密，可用强去垢剂(可耐受2% SDS)洗涤，消除非特异性结合蛋白，降低背景。
本产品中采用的miniTurboID是BioID的改进增强版本。miniTurboID是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶人工改造获得的TurboID的基础上，进一步截短、突变得到的新型生物素连接酶。miniTurboID技术和BioID相比具有多方面的优点。①更灵活的生物素标记半径：在质粒构建时可通过选择不同的酶切位点，在miniTurboID和诱饵蛋白之间调节是否表达linker (13X GGGGS repeats, ~25nm)控制邻近蛋白生物素标记的半径，不表达linker的miniTurboID融合蛋白生物素标记半径为~10nm，而表达linker的miniTurboID融合蛋白生物素标记半径为~35nm。这种生物素标记半径选择的灵活性，适合研究体积较大的蛋白和较大的蛋白复合物。②更好的生物素标记效果：BioID分子量约35kDa，而miniTurboID分子量仅约28kDa，因此miniTurboID对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。③更高的生物素连接酶活性：BioID通常需要16小时才能有效标记相互作用的蛋白质，而miniTurboID最快10分钟就可以达到相似的效果。④更宽的反应温度范围：BioID反应温度低于37℃时酶活明显降低，虽然miniTurboID的最佳反应温度为30℃，但是miniTurboID在16℃-37℃也具有良好的生物素标记活性[4]。
碧云天各种邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择，请参考 https://www.beyotime.com/support/BioID.htm
本质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。
pCMV-miniTurboID-Flag质粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 235-818 |
| miniTurboID | 907-1680 |
| 3X Flag Tag | 1687-1752 |
| BGH poly(A) signal | 1787-2011 |
| f1 ori | 2057-2485 |
| SV40 promoter | 2499-2828 |
| Neomycin resistance gene | 2895-3689 |
| SV40 poly(A) signal | 3863-3984 |
| lac operator | 4057-4073 |
| lac promoter | 4081-4111 |
| CAP binding site | 4126-4147 |
| ori | 4435-5020 |
| Ampicillin resistance gene | 5191-6051 |
| Ampicillin promoter | 6052-6156 |
pCMV-miniTurboID-Flag质粒(6187bp)的图谱如下：
pCMV-miniTurboID-Flag表达基因的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D3037 pCMV-miniTurboID-Flag (阴性对照质粒).pdf。
pCMV-miniTurboID-Flag中没有的酶切位点包括：
| AarI | AbsI | AccIII | Acc65I | AcvI | AfeI | AflII |
| AgeI | AjiI | AjuI | AleI | Aor13HI | Aor51HI | AscI |
| AsiGI | AsiSI | Asp718I | AxyI | BaeI | BamHI | BarI |
| BbrPI | BfrI | BlpI | BmgBI | BoxI | Bpu1102I | Bse21I |
| BseAI | BsgI | BshTI | BsiWI | BsmBI | Bsp13I | Bsp1407I |
| Bsp1720I | BspEI | BspTI | BsrGI | Bst98I | BstAFI | BstAUI |
| BstEII | BstHPI | BstPI | BstPAI | Bsu36I | BtrI | CciNI |
| CelII | Cfr42I | CspAI | Eco32I | Eco47III | Eco72I | Eco81I |
| Eco91I | EcoO65I | EcoRI | EcoRV | Esp3I | FseI | FspAI |
| HindIII | HpaI | I-CeuI | I-PpoI | I-SceI | KflI | KpnI |
| Kpn2I | KspI | KspAI | MauBI | MreI | MroI | MspCI |
| NotI | OliI | PacI | PaeR7I | PalAI | PasI | Pfl23II |
| PI-PspI | PI-SceI | PinAI | PmaCI | PmlI | PpuMI | PshAI |
| Psp5II | PspCI | PspEI | PspLI | PspPPI | PspXI | PsrI |
| RgaI | RigI | SacII | SanDI | SfaAI | SfiI | Sfr274I |
| Sfr303I | SgfI | SgrBI | SgsI | SlaI | SmiI | SrfI |
| SspBI | SstII | SwaI | TstI | Vha464I | XbaI | XhoI |
pCMV-miniTurboID-Flag中的单酶切位点包括：
| AhdI | AvaI | AvrII | BbsI | BbvCI | BglII | BmeT110I |
| BmtI | BsmI | BsoBI | BspDI | BssHII | BstBI | BstXI |
| BstZ17I | ClaI | DraIII | EagI | Eco53kI | EcoNI | MfeI |
| MluI | NdeI | NheI | NruI | PciI | PflFI | PflMI |
| PfoI | PmeI | PvuI | RsrII | SacI | ScaI | SexAI |
| SgrAI | SgrDI | SmaI | SnaBI | SpeI | SspI | TspMI |
| Tth111I | XmaI |
pCMV-miniTurboID-Flag质粒中推荐使用的测序引物序列如下：
CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'
BGH-R (1781-1798): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'
pCMV-miniTurboID-Flag的全序列信息:D3037 pCMV-miniTurboID-Flag.txt。
包装清单：| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| D3037-1µg | pCMV-miniTurboID-Flag | 1µg |
| D3037-100µg | pCMV-miniTurboID-Flag | 100µg |
| － | 说明书 | 1份 |
-20℃保存。
注意事项：本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
