pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒)
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pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA是碧云天自行研发的用于在大肠杆菌(E.coli)中表达生物素标记蛋白的质粒。该质粒带有两组T7启动子/lac操作子和核糖体结合位点(Ribosome binding site, RBS),其中一组的多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)前有His标签(His tag)、Avi标签(Avi tag)和SUMO3标签(SUMO3 tag),另一组用于表达带有S标签(S tag)的生物素连接酶(Biotin ligase) BirA,因此都可以在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下高效启动目的蛋白和BirA的共表达。在ATP和生物素(Biotin)存在的条件下,细胞内表达的生物素连接酶BirA催化生物素共价结合到目的蛋白N端的Avi标签上,从而可以在表达目的蛋白的同时进行生物素标记。同时,本质粒带有SUMO3标签,可被rSENP2蛋白酶特异性的识别并切割,从而实现相应标签蛋白与目的蛋白的高效分离。本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)抗性。

Avi标签是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签,在ATP和生物素存在的条件下,BirA可以在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素,从而实现目的蛋白的生物素标记[1]。

生物素连接酶BirA特异性生物素标记Avi-tag有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小,只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记,生物素标记效率高,可重复性好;体内或体外均可进行标记,标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高,从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等;相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记,BirA催化的反应条件更温和,对被标记蛋白活力影响小,酶活效率高,标记特异性强[1]。

类泛素蛋白修饰分子(Small ubiquitin-like modifier, SUMO),也被称为泛素样修饰因子小蛋白、泛素样小分子修饰因子或小泛素相关修饰物,是广泛存在于真核生物的蛋白家族。和泛素化(Ubiquitination)类似,类泛素蛋白修饰分子通过类泛素蛋白(Ubiquitin-like proteins, Ubls)活化酶(Ubl activating enzyme, E1)、结合酶(Ubl conjugating enzyme, E2)和连接酶(Ubl protein ligase, E3)共价连接到特定蛋白的赖氨酸上,这一过程被称为SUMO化修饰(SUMOylation)。SUMO化修饰是一种翻译后修饰,参与细胞的调控,如细胞核到细胞膜的运输、转录调控、细胞凋亡、蛋白质的稳定、压力应激和细胞周期的调控等[2]。

SUMO3标签源自人SUMO3基因,在大肠杆菌体系中SUMO3标签可以作为分子伴侣帮助目的蛋白在表达过程中正确折叠,提高目的蛋白的可溶性和表达量。SUMO3标签在体外可以被rSENP2蛋白酶特异性的识别并切割,从而实现SUMO3标签与目的蛋白的高效分离,切割后的目的蛋白不带有任何相应标签氨基酸的残留,因此SUMO3标签适用于大肠杆菌重组蛋白的表达和纯化[3]。

本质粒表达的目的蛋白可以采用如BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐还原螯合型) (P2210/P2218/P2220)His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型) (P2226)以及BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型) (P2233)His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型) (P2229S)等进行纯化。

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
T7-1 promoter 6664-2
Avi tag 83-127
His tag 137-154
SUMO3 tag 161-436
Multiple Cloning Sites 434-484
T7-2 promoter 542-560
BirA 631-1593
S tag 1606-1650
T7 Terminator 1420-1467
f1 origin 1786-2241
Ampicillin 2356-3216
ori 3390-3978
lacI 5171-6253

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA质粒(6660bp)的图谱如下:

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA表达基因的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D3015 pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒).pdf

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA中没有的酶切位点包括:

AatII AbsI Acc65I AcvI AgeI AhlI AleI
AsiGI AsiSI Asp718I AsuII AsuNHI BaeI BbrPI
BcuI BglII BmtI BoxI BplI Bpu14I BshTI
BsiWI Bsp68I Bsp119I BspOI BspT104I BstBI BstPAI
BstSNI BtuMI Cfr9I Cfr42I CpoI CsiI CspI
Csp45I CspAI CspCI Eco32I Eco72I Eco105I EcoRV
EcoT22I FalI FseI FspAI I-CeuI I-PpoI I-SceI
KflI KpnI KspI MabI MauBI MfeI Mph1103I
MreI MssI MunI NheI NruI NsiI NspV
OliI Pfl23II PI-PspI PI-SceI PinAI PmaCI PmeI
PmlI PshAI PspCI PspLI PsrI RgaI RigI
RruI RsrII Rsr2I SacII SanDI SexAI SfaAI
SfiI Sfr303I SfuI SgfI SgrBI SgrDI SmaI
SmiI SnaBI SpeI SrfI SstII SwaI TspMI
XmaI XmaCI ZraI Zsp2I

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA中的单酶切位点包括:

AflII A`CRYG,T 491 NotI GC`GGCC,GC 478
AhdI GACNN,N`NNGTC 2429 PacI TTA,AT`TAA 1669
AvrII C`CTAG,G 1673 PaeR7I C`TCGA,G 1594
BamHI G`GATC,C 434 PciI A`CATG,T 4034
BbvCI CC`TCA,GC 1111 PflFI GACN`N,NGTC 4292
BmgBI CAC|GTC 412 PpuMI RG`GWC,CY 5029
BspQI GCTCTTCN`NNN, 4151 PsiI A`CATG,T 2144
BsrGI T`GTAC,A 518 PspXI VC`TCGA,GB 1594
BstAPI GCAN,NNN`NTGC 6222 PvuI CG,AT`CG 2799
BstEII G`GTNAC,C 5716 SacI G,AGCT`C 450
BstZ17I GTA|TAC 4267 SalI G`TCGA,C 465
Bsu36I CC`TNA,GG 1576 SapI GCTCTTCN`NNN, 4151
DraIII CAC,NNN`GTG 2019 ScaI AGT|ACT 2909
Eco53kI GAG|CTC 448 SgrAI CR`CCGG,YG 6579
EcoRI G`AATT,C 440 SphI G,CATG`C 6431
FspI TGC|GCA 2651 SspI AAT|ATT 2224
HindIII A`AGCT,T 471 StuI AGG|CCT 293
HpaI GTT|AAC 5396 Tth111I GACN`N,NGTC 4292
MluI A`CGCG,T 5898 XbaI T`CTAG,A 30
NcoI C`CATG,G 69 XhoI C`TCGA,G 1594
NdeI CA`TA,TG 626

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA质粒中推荐使用的测序引物序列如下: T7-R (542-561): 5'-CCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'

pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA的全序列信息:D3015 pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA(生物素标记原核表达质粒).txt

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D3015-1µg pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA 1µg
D3015-100µg pET-Dual-Avi-His-SUMO3-MCS-BirA 100µg
说明书 1份
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转化。
3.本质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,构建的质粒可以用常规方法转入表达菌株。
参考文献:
1.Millard G.Cull, Peter J.Schatz. Methods in Enzymology. 2000. Volume 326:430-440.
2.Hay RT. Mol Cell. 2005. 18(1):1-12.
3.Marblestone et al., Protein Science.2006. 15:182-189.
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