pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达可被生物素标记的目的蛋白的质粒。该质粒由CMV启动子驱动带有3X Flag tag和Avi tag (Avi标签)的目的蛋白。在ATP和生物素(Biotin)存在的条件下，生物素连接酶(biotin ligase) BirA可以催化Biotin共价结合到目的蛋白N端的Avi标签上，从而在体内或体外对目的蛋白进行生物素标记。在多克隆位点的5’端还含有一个编码3XFlag标签的序列，这样可以表达同时含有Flag标签和Avi标签的融合蛋白，在可以进行生物素标记的同时，也可以方便地使用Flag标签抗体来识别目的蛋白，从而便于目的蛋白检测和分离纯化。

Avi标签(Avi-tag)是由15个氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)组成的短肽标签，在ATP和生物素存在的条件下，生物素连接酶BirA可以在Avi标签的赖氨酸残基上连接一个生物素，从而实现目的蛋白的生物素标记。

生物素连接酶BirA特异性生物素标记Avi-tag有多方面的优点。Avi标签小且对融合蛋白的影响非常小，只针对Avi标签上的Lys残基进行特定位置的生物素标记，生物素标记效率高，可重复性好；体内或体外均可进行标记，标记后的蛋白与链霉亲和素(Streptavidin)的亲和力高，从而使Avi-tag技术可以应用于目的蛋白的固定吸附、纯化和检测等；相比于传统生物素化学标记的非特异性位点的标记，BirA催化的反应条件更温和，对被标记蛋白活力影响小，酶活效率高，标记特异性强。

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌。而在转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081/ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。G418和Neomycin效果一致，但G418的细胞毒性更低。

本质粒在N端3X Flag标签与Avi标签之间含有HRV 3C蛋白酶识别的八肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，因此可在目的蛋白纯化后用HRV 3C蛋白酶切除N端的3X Flag标签。HRV 3C蛋白酶酶切发生在八肽序列的Gln和Gly之间，因此在酶切去除3X Flag标签的时候目的蛋白的N端会留下两个额外的氨基酸残基Gly和Pro。

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo质粒的主要信息如下：

pCMV-3X Flag-Avi-MCS质粒(6203bp)的图谱如下：

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo表达基因的详细图谱见说明书：https://www.beyotime.com/Manual/D2973 pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo (Avi标签质粒).pdf。

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo中没有的酶切位点包括：

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo中的单酶切位点包括：

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (583-603): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGT-3'

pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo的全序列信息：D2973 pCMV-N-3X Flag-Avi-Neo.txt。

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本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。