pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA
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pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA是碧云天研发生产的以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为表达菌株,带有双启动子的表达质粒。本质粒可以在多克隆位点(Multiple cloning sites, MCS)按照开放读码框(Open reading frame, ORF)插入不带有终止密码子的目的基因,经半乳糖诱导可以通过GAL1 promoter表达C端带有His标签(His Tag, HHHHHH)的目的蛋白或通过GAL10 promoter表达C端带有Flag标签(Flag Tag, DYKDDDDK)的目的蛋白,并且这两种蛋白可以同时表达。

酿酒酵母是真核生物,基因组约1.2×107bp,细胞核内含有16条染色体,约6000个ORF,仅4%的酵母基因有内含子,遗传背景简单[1]。酿酒酵母具有类似原核生物的生长特性,便于培养和进行遗传操作,是一种模式真核生物,被称为真核生物的“大肠杆菌”。酿酒酵母表达系统表达外源基因时具有一定的翻译后加工能力,收获的外源蛋白质在一定程度上进行了折叠加工和糖基化修饰,有利于保持蛋白的活性和稳定性,并且外源基因可在酿酒酵母中分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化,还避免了产物在胞内大量蓄积[2]。

酿酒酵母能够以半乳糖为唯一碳源。半乳糖通过特定的半乳糖苷通透酶(Galactoside permease)运输到细胞中,并通过半乳糖激酶、α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶和尿苷二磷酸葡萄糖-4-差异构酶的顺序作用转化为葡萄糖-1-磷酸,这三种酶分别由名为GAL1、GAL7和GAL10的一簇紧密联系的基因编码[3]。酿酒酵母转化时质粒的选择基于营养缺陷型突变菌株的使用,如果没有特定的培养基成分(氨基酸、嘌呤或嘧啶),突变菌株就无法生长,因此用与突变基因互补的质粒进行转化使转化子就能够在缺乏所需营养成分的培养基上生长。

本质粒含有相反方向的酵母启动子GAL1和GAL10,可以将一个或两个目的基因引入酵母宿主菌株中。在GAL10 promoter后的MCS插入目的基因时,需要目的基因带有起始密码子,而在GAL1 promoter后的MCS插入目的基因时,由于α-factor信号肽已带有起始密码子,插入的目的基因不需要带有起始密码子。当两个基因分别插入两个MCS共表达时,可以通过免疫沉淀分析确认蛋白质与蛋白质的相互作用。本质粒含有酵母2μ origin复制子,2μ origin的序列最初是从天然存在的酵母2μ质粒中分离出来,因此含有2μ origin能够在酿酒酵母中自主复制质粒。

本质粒含有α-factor信号肽序列,可以用于目的蛋白的分泌表达。α-factor信号肽引导目的蛋白进入分泌通路后,Kex2基因编码的类枯草菌素蛋白酶(Subtilisin-like protease)识别α-factor C末端的EKREAEA序列,并在KR之后进行剪切,这样目的蛋白N端会携带4个氨基酸残基(EAEA),此时可能被Ste13基因编码的二肽蛋白酶氨基肽酶A (Dipeptidyl aminopeptidase A)识别并切割,因此分泌到胞外的目的蛋白的N端可能会残留2-4个氨基酸残基。

本质粒含有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和URA3筛选标记。在大肠杆菌中呈现氨苄青霉素抗性。本质粒转化酵母细胞后,可利用URA3筛选标记,转化酿酒酵母Ura营养缺陷型菌株,如酿酒酵母INVSc1 (D0432),在不含Uracil的培养基中筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA质粒的主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
URA3 promoter 201..416  
URA3 417..1220
f1 ori 1351..1806
ADH1 terminator 1885..2050
FLAG 2198..2221
GAL1,10 promoter 2268..2932
UAS 2484..2601
T7 promoter 2943..2961
α-factor secretion signal 2968..3237
6xHis 3286..3303
CYC1 terminator 3311..3500
ori 3743..4331
AmpR 4502..5362
AmpR promoter 5363..5467
2μ ori 5494..6836
FRT 6457..6504

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA质粒(6904bp)的图谱如下:

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA的多克隆位点的详细图谱见说明书:https://www.beyotime.com/Manual/D2892 pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA.pdf

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA中没有的酶切位点包括:

AarI AatII AbsI AccIII AccB7I AcvI AflII
AleI Aor13HI AscI AsiSI AspI AspA2I AvrII
AxyI BaeI BalI BbeI BbrPI BbvCI BclI
BfrI BlnI BlpI BoxI BplI Bpu1102I BsaBI
Bse8I Bse21I BseAI BseJI BsePI BsiWI Bsp13I
Bsp68I Bsp1720I BspEI BspTI BssHII Bst98I BstAFI
BstEII BstENI BstHPI BstPI BstPAI Bsu36I BtuMI
CelII CpoI CsiI CspI DinI Eco72I Eco81I
Eco91I EcoNI EcoO65I EgeI EheI FbaI FseI
FspAI HpaI I-CeuI I-PpoI I-SceI KasI KflI
Kpn2I Ksp22I KspAI MabI MamI MauBI MlsI
MluNI Mly113I Mox20I MreI MroI MscI Msp20I
MspCI MssI NarI Nb.BbvCI NruI Nt.BbvCI OliI
PalAI PaqCI PasI PauI Pfl23II PflFI PflMI
PI-PspI PI-SceI PluTI PmaCI PmeI PmlI PshAI
PspCI PspEI PspLI PsrI PsyI PteI RgaI
RigI RruI RsrII Rsr2I SanDI SexAI SfaAI
SfiI SfoI SgfI SgrAI SgrDI SgsI SmiI
SrfI SspDI SwaI Tth111I Van91I Vha464I XagI
XmaJI ZraI        

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA中的单酶切位点包括:

Acc65I AgeI AhdI ApaI BamHI BfuAI BglII
BmgBI BmtI Bpu10I BsaHI BsgI BsmI BspDI
BspMI BsrGI BstXI ClaI CspCI EagI Eco53kI
EcoRI EcoRV HindIII KpnI MfeI MluI NaeI
NcoI NdeI NgoMIV NheI NotI PacI PspOMI
PspXI PstI SacI SacII SalI SbfI SmaI
SnaBI SpeI SphI StuI TspMI XmaI

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA质粒中对于插入片段进行测序时,推荐使用的正向测序引物GAL1-F、GAL10-F和反向测序引物GAL1-R、GAL10-R的序列如下:

GAL1-F (2837-2857): 5'-ATTTTCGGTTTGTATTACTTC-3'

GAL1-R (3377-3397): 5'-GTTCTTAATACTAACATAACT-3'

GAL10-F (2319-2340): 5'-GGTGGTAATGCCATGTAATATG-3'

GAL10-R (2118-2140): 5'-GGCAAGGTAGACAAGCCGACAAC-3'

pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA的全序列信息:D2892 pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA全序列.txt

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D2892-100µg pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA 100µg
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-20℃保存。

注意事项:

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途,也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.首次使用1µg包装的本产品时,请先取少量本质粒转化大肠杆菌,进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定,或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl,共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.pGAL1,10-α factor-MCS-His-MCS-Flag-URA质粒在其多克隆位点适当酶切后可以插入待表达的目的基因,需注意插入基因片段和tag之间的读码框要一致,即需要避免发生移码突变。
参考文献:
1.Goffeau A, Barrell BG, Bussey H, Davis RW, Dujon B, et al. Science. 1996. 274(5287):546, 563-7.
2.Bussineau CM, Shuster JR. Dev Biol Stand. 1994. 83:13-9.
3.Yocum RR, Hanley S, West R Jr, Ptashne M. Mol Cell Biol. 1984. 4(10):1985-98.
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